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1、附件 1食品中大黃酚和橙黃決明素的測(cè)定BJS 2019161 范圍本方法規(guī)定了食品(含保健食品)中大黃酚和橙黃決明素的高效液相色譜測(cè)定方法。本方法適用于飲料、代用茶等食品及片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等劑型的保健食品中大黃酚和橙黃決明素的含量測(cè)定。2 原理試樣經(jīng)甲醇回流提取后,再以稀鹽酸水解,二氯甲烷萃取, 采用配有二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀檢測(cè),外標(biāo)法定量。3 試劑和材料除另有說(shuō)明外,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。3.1 試劑3.1.1甲醇( CH 3OH) :色譜純。3.1.2乙腈( C2H3N):色譜純。3.1.3磷酸( H 3PO4)。
2、3.1.4二氯甲烷( CH2CL 2)。3.1.5鹽酸( HCL )。3.1.6無(wú)水乙醇( CH 3CH2OH )。1乙酸乙酯( C4H 8O2)。甲酸( CH2O2)。3.2 試劑配制3.2.1磷酸水溶液( 0.1%):取磷酸( 3.1.3)1.0mL ,加水定容至 1000mL 。3.2.2稀鹽酸:取鹽酸( 3.1.5) 234mL ,用水溶解并定容至1000mL 。3.2.3無(wú)水乙醇 -乙酸乙酯( 2+1 )混合溶液:取無(wú)水乙醇500mL 與乙酸乙酯 250mL ,混勻。甲酸水溶液(0.1%):取甲酸()1.0mL ,加水稀釋并定容至1000mL 。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品橙黃決明素、大黃酚的標(biāo)準(zhǔn)
3、品的分子式、相對(duì)分子量、CAS 登錄號(hào)見(jiàn)附錄A 表 A.1 。橙黃決明素的純度98%,大黃酚的純度99%。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 g/mL):分別稱(chēng)取大黃酚、橙黃決明素(3.3)各0.0100g (精確至0.0001g),置 100mL 棕色量瓶中,用無(wú)水乙醇-乙酸乙酯( 2+1 )混合溶液()溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為100g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,0 4冷藏保存,有效期6 個(gè)月?;旌?標(biāo)準(zhǔn) 中間液( 20 g/mL):分 別準(zhǔn)確吸取 大黃酚、橙 黃決明素標(biāo) 準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 各 5mL ,置同一25mL 棕色量瓶中,用無(wú)水乙醇-乙酸乙酯( 2+1 )混合溶液()稀釋至刻
4、度,搖勻。0 4冷藏保存,有效期1 個(gè)月。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別準(zhǔn)確吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,用無(wú)水乙醇-乙酸乙酯( 2+1 )混合溶液()稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,該標(biāo)準(zhǔn)系列中大黃酚和橙黃決明素濃度為 0.2 g/mL、 0.5 g/mL、 2.0 g/mL、 4.0 g/mL、 10.0 g/mL 、 20.0 g/mL。臨用新制。4 儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜儀:配有二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器。24.2 超聲波清洗器。4.3 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)。4.4 分析天平:感量分別為0.01g 和 0.01mg。4.5 電熱恒溫水浴鍋。4.6 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。4.7 氮吹儀。5 分析步驟5.1 試樣
5、制備固態(tài)試樣或半固態(tài)試樣取適量固態(tài)試樣(代用茶及片劑、膠囊內(nèi)容物、顆粒劑等保健食品)混勻,研細(xì),或取適量半固態(tài)試樣(軟膠囊內(nèi)容物)混勻,稱(chēng)取0.5g 1g(精確至0.001g),置平底燒瓶中,加入甲醇50mL ,混勻,稱(chēng)定重量,加熱回流1h,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),精密吸取續(xù)濾液25mL 于平底燒瓶中,蒸干(或氮吹至干),加入稀鹽酸()30mL ,超聲 2min ,加熱回流水解1h,立即冷卻,置于分液漏斗中,先用少量水洗滌燒瓶,再用少量二氯甲烷洗滌燒瓶,并入分液漏斗中,酸液再用二氯甲烷振搖提取4 次,用量依次為40mL 、30mL 、30mL 、20mL ,合并二氯
6、甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘?jiān)脽o(wú)水乙醇 -乙酸乙酯( 2:1)混合溶液()溶解,轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中,定容至刻度,溶液經(jīng) 0.45 m 有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi),備用。液態(tài)試樣取適量試樣(飲料、口服液)混勻,準(zhǔn)確吸取2.0 5.0mL ,置平底燒瓶中,水浴蒸干,3加入稀鹽酸() 10mL,超聲 2min,加熱回流水解1h,立即冷卻,置于分液漏斗中,用少量水洗滌燒瓶,再用少量二氯甲烷洗滌燒瓶,并入分液漏斗中,酸液再用二氯甲烷振搖提取 4 次,用量依次為 15mL 、 10mL 、 10mL、 10mL ,合并二氯甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘?jiān)?/p>
7、無(wú)水乙醇 -乙酸乙酯( 2:1)混合溶液()溶解,轉(zhuǎn)移至 25mL 容量瓶中,定容至刻度,溶液經(jīng) 0.45 m 有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi),備用。5.2 色譜參考條件5.2.1色譜柱: BDS HYPERSIL C 18( 4.6mm250mm, 5m)或性能相當(dāng)者。5.2.2流動(dòng)相: A 相為甲醇, B 相為 0.1%磷酸水溶液(3.2.1) ,洗脫梯度程序見(jiàn)表 1。5.2.3流速: 1.0mL/min 。5.2.4柱溫: 30。5.2.5檢測(cè)波長(zhǎng): 284nm。5.2.6進(jìn)樣量: 10L。表 1 梯度洗脫程序表梯度時(shí)間( min )流動(dòng)相 A(
8、%)流動(dòng)相 B(%)060401560402290103290103760404060405.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液()按液相色譜參考條件(5.2)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定相應(yīng)的色譜峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度(g/mL)為橫坐標(biāo),以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.4 試樣溶液的測(cè)定4將試樣溶液(5.1)按液相色譜參考條件(5.2)進(jìn)行測(cè)定,得到相應(yīng)樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中組分的濃度,平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次。6 結(jié)果計(jì)算固態(tài)或半固態(tài)試樣中大黃酚和橙黃決明素含量按式(1)計(jì)算:C VV11000( 1)Xm1000V0式中:X 試樣中大黃酚或橙黃決明素的含量,單位
9、為毫克每千克(mg/kg );C 試樣中所測(cè)的大黃酚或橙黃決明素的濃度,單位為微克每毫升( g/mL);V 試樣最終定容體積,單位為毫升(mL );V1 最初加入甲醇的體積,單位為毫升(mL );V0 試樣加酸水解前取濾液體積,單位為毫升(mL);m 試樣稱(chēng)取的質(zhì)量,單位為克(g);液態(tài)試樣中大黃酚和橙黃決明素含量按式(2)計(jì)算:C V1000( 2)X1000V0式中:X 試樣中大黃酚或橙黃決明素的含量,單位為毫克每升(mg/L );C 試樣中所測(cè)的大黃酚或橙黃決明素的濃度,單位為微克每毫升( g/mL);V 試樣最終定容體積,單位為毫升(mL );V0 試樣吸取體積,單位為毫升(mL );
10、計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有5效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。8 檢出限固體或半固體試樣:當(dāng)稱(chēng)樣量為0.5g 時(shí),該方法測(cè)定條件下,橙黃決明素和大黃酚的檢出限均為4mg/kg ,定量限為12mg/kg 。液體試樣:當(dāng)取樣量為5mL 時(shí),該方法測(cè)定條件下,橙黃決明素和大黃酚的檢出限均為 0.2mg/L ,定量限為0.6mg/L 。6附錄 A化合物相關(guān)信息表 A.1 大黃酚和橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)品的中、英文名稱(chēng)、CAS 登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量中文名稱(chēng)英文名稱(chēng)CAS 登錄號(hào)分子式相對(duì)分子量大黃酚C
11、hrysophanol481-74-3C15H10O4254.23橙黃決明素Aurantio-obtusin67979-25-3C17H14O7330.297附錄 B大黃酚和橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖mAU252120151050-50.05.010.015.020.025.030.035.0min圖 B.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖1.橙黃決明素; 2.大黃酚8附錄 C定性確證試驗(yàn)C.1. 色譜參考條件a) 色譜柱: C18 柱, 1.7 m,1003.0mm(內(nèi)徑),或性能相當(dāng)者。b) 流動(dòng)相: A 相為 0.1% 甲酸水溶液(); B 相為乙腈();A+B=40+60 。c) 流速: 0.3m
12、L/min 。d) 柱溫: 35。e) 進(jìn)樣量: 1L。C.2 質(zhì)譜參考條件f) 離子源:電噴霧離子源 (ESI)。g) 檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 。h) 掃描方式:正離子掃描 (ESI+ )。i) 毛細(xì)管電壓: 3000V 。j) 噴嘴電壓: 1500V 。k) 霧化氣溫度: 200。l) 霧化氣流速: 14.0 L/min 。m) 霧化氣壓力: 20psi。n) 鞘氣流速: 11.0L/min 。o) 鞘氣溫度: 250。p) 其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表 C.1。表 C.1 化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)母離子子離子碰撞能量保留時(shí)間序號(hào)化合物名稱(chēng)電離方式( m/z)(m/z)(V)(min
13、 )91ESI +330.8297.8*1.298橙黃決明素28269.82ESI +254.9151.9*4.277大黃酚40180.6* 定量離子。注:1.本方法提供質(zhì)譜條件為推薦質(zhì)譜方法條件??筛鶕?jù)實(shí)際情況,選擇響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)且無(wú)干擾的離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)譜參數(shù)亦可根據(jù)實(shí)際可達(dá)到最優(yōu)靈敏度的條件進(jìn)行設(shè)定。2.如實(shí)際樣品中有檢出,通過(guò)保留時(shí)間及DAD 光譜圖不能準(zhǔn)確定性,可以附錄C 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確證。C.3 定性判定按照 C.1 和 C.2 的條件測(cè)定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液,記錄樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中目標(biāo)物的保留時(shí)間。若樣品中檢出與混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中待測(cè)物保留時(shí)間一致的色譜峰(變化范圍在2.5%之內(nèi)),且其定性離子與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度相比偏差不超過(guò)表2 規(guī)定的范圍,則可以確定樣品中檢出相應(yīng)的待測(cè)物。表 C.2 定性確定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度(%)k 50%50%k20%20%k10%k10%允許的
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