食品中硼酸的快速檢測姜黃素比色法(KJ201909)

1、附件 9食品中硼酸的快速檢測姜黃素比色法（ KJ201909）1 范圍本方法規(guī)定了食品中硼酸的姜黃素比色快速檢測方法。本方法適用于糧食制品、淀粉及淀粉制品、糕點、豆制品、速凍食品（速凍面米食品、肉丸、蔬菜丸）中硼酸的快速測定。2原理本方法采用姜黃素比色法的原理，通過超聲輔助用水提取樣品中硼酸，用乙基己二醇三氯甲烷溶液對樣品中的硼酸進行快速的富集、萃取，利用硫酸與姜黃素混合生成的質(zhì)子化姜黃與硼酸反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物。溶液顏色的深淺與樣品中硼酸的含量成正相關(guān)，通過色階卡-進行目視比色，確定樣品中硼酸的含量。3 試劑與材料除另有規(guī)定外，本方法所用的試劑均為分析純，水為GB/T6682 規(guī)定的二級水。3.

2、1試劑硫酸。無水乙醇。亞鐵氰化鉀。乙酸鋅。姜黃素（ CAS:458-37-7 ），純度 99%。冰乙酸。2-乙基 -1,3-己二醇（色譜純）。三氯甲烷（色譜純）。硫酸溶液（ 1+1 ）：取等體積的硫酸（）與水，將硫酸緩慢加入到水中，并用玻璃棒不斷的攪拌，待冷卻后裝入塑料容器中。3.1.10亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6 g 亞鐵氰化鉀（ 3.1.3），用水溶解并稀釋至 100 mL 。3.1.11乙酸鋅溶液：稱取 22.0 g 乙酸鋅（ 3.1.4），用水溶解并稀釋至 100 mL 。3.1.122-乙基 -1,3-己二醇 -三氯甲烷溶液 (EHD-CHCl3 溶液 )：稱取 2-乙基 -1,3

3、-己二醇 (3.1.7)10.6g，用三氯甲烷 (3.1.8)溶解并稀釋至100 mL ，此溶液保存于塑料容器中。3.1.13姜黃 -冰乙酸溶液：稱取姜黃素(3.1.5)40 mg ，溶于 100 mL 冰乙酸 (3.1.6) 中，此溶液保存于塑料容器中，該溶液需臨用新制。3.2參考物質(zhì)硼酸參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS 號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1。表 1 硼酸參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS 號、分子式、相對分子質(zhì)量中午名稱英文名稱CAS 登錄號分子式相對分子質(zhì)量硼酸Boric Acid10043-35-3H 3BO361.83.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.3.1硼酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（ 1000g

4、/mL）：準(zhǔn)確稱取在硫酸干燥器中干燥5 h 以上的硼酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解并配制成1000g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于塑料容器中。3.3.2硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 g/mL）：取硼酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液10.0 mL ，加水定容至100 mL ，保存于塑料容器中。所配制溶液于0 4冰箱中可儲存3 個月。3.4材料硼酸快速檢測試劑盒，需在陰涼、干燥、避光條件下保存。4 儀器與設(shè)備4.1電子天平： 感量為 0.01 g。4.2樣品搗碎機。4.3超聲儀。4.4離心機：轉(zhuǎn)速4000 r/min。4.5氮氣吹干儀或空氣吹干儀：溫度控制60。4.6渦旋振蕩器。4.7移液器： 200 L 、 1 mL 、10 mL 。

5、5 分析步驟5.1試樣的制備取適量樣品，充分粉碎混勻。5.2試樣的提取準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣2 g（精確至0.1 g），置于 50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加水 7 mL ，加入硫酸溶液（ 3.1.9） 2 mL ，渦旋振蕩提取1min 后超聲提取15 min ，期間振搖 23 次，加入 0.5mL 亞鐵氰化鉀溶液（3.1.10）與 0.5 mL 乙酸鋅溶液（3.1.11），混勻后于 4000 r/min離心 5 min( 若離心效果不佳，可適當(dāng)提高離心轉(zhuǎn)速 )，準(zhǔn)確吸取1.0 mL 上清液于 2.0 mL 離心管中，向離心管中加入EHD-CHCl 3 溶液（） 0.5 mL ，上下顛倒振搖15

6、20 次，靜置分層（若有乳化現(xiàn)象，可低速離心），將上層溶液去除干凈，取下層液體100 L于 2.0 mL離心管中，加入400 L姜黃素 -冰乙酸溶液（），再加入20 L硫酸溶液（），于 60 70水浴中氮氣 （或空氣） 吹至近干， 加入 1 mL 無水乙醇， 振搖使殘渣全部溶解，為待測液。注：粉絲、粉條等干基樣品加入水和硫酸溶液后需浸泡15 min ，再進行后續(xù)處理。5.3測定步驟將待測液與標(biāo)準(zhǔn)色階卡目視比色， 15 min 內(nèi)判讀結(jié)果。需進行平行試驗，兩次測定結(jié)果應(yīng)一致，即顯色結(jié)果無肉眼可辨識差異。注：整個試驗避免在陽光直射的地方操作。5.4質(zhì)控試驗每批樣品應(yīng)同時進行空白試驗和質(zhì)控樣品試驗

7、（或加標(biāo)質(zhì)控試驗） 。用色階卡和質(zhì)控試驗同時對檢測結(jié)果進行控制。空白試驗稱取空白樣品，按照5.15.3步驟與樣品同法操作。質(zhì)控樣品試驗（或加標(biāo)質(zhì)控試驗）質(zhì)控樣品硼酸質(zhì)控樣品： 采用典型樣品基質(zhì)或相似樣品基質(zhì)模擬實際生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的，含有一定量硼酸 (可考慮基質(zhì)本底最大可能硼酸量)，并可穩(wěn)定保存的樣品。樣品需經(jīng)參比方法確認(rèn)質(zhì)控樣品中硼酸的含量。加標(biāo)質(zhì)控樣品硼酸加標(biāo)質(zhì)控樣品： 準(zhǔn)確稱取空白試樣2 g（精確至0.1 g），加入適量硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 1000g/mL 或 100 g/mL ）（ 3.3），使在不同基質(zhì)樣品中硼酸含量與相同。質(zhì)控樣品（或加標(biāo)質(zhì)控樣品）按5.1和 5.2步驟與樣品同法操作。6

8、結(jié)果判定要求觀察待測液的顏色，與標(biāo)準(zhǔn)色階卡比較判讀樣品中硼酸的含量。顏色淺于檢測限（2.5mg/kg ）則為陰性樣品；顏色深于檢測限的根據(jù)顏色的深淺進行判讀。色階卡見圖1。圖 1 硼酸色階卡質(zhì)控試驗要求： 空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性， 質(zhì)控樣品試驗測定結(jié)果應(yīng)在其標(biāo)示量值允差范圍內(nèi)，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)與加標(biāo)量相符。7 結(jié)論由于色階卡目視判讀存在一定誤差， 為盡量避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果， 讀數(shù)時遵循就高不就低的原則。8 性能指標(biāo)8.1檢測限2.5mg/kg 。8.2靈敏度靈敏度應(yīng) 99%。8.3特異性特異性應(yīng) 85%。8.4假陰性率假陰性率應(yīng) 1%。8.5假陽性率假陽性率應(yīng) 15%。注：性能指標(biāo)計算

9、方法見附錄A 。9其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不作限定。 方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項性能指標(biāo)。色階卡應(yīng)確保在試劑盒保質(zhì)期內(nèi)不出現(xiàn)褪色或變色的情況。若檢測結(jié)果大于檢測限，需對其進行研判，并采用參比方法確證。本方法的參比方法為GB 5009.275-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硼酸的測定 。附錄 A快速檢測方法性能指標(biāo)計算表表 A.1性能指標(biāo)計算方法樣品情況 a檢測結(jié)果 b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12

10、N.2=N21+N22N=N1.+N2. 或 N.1+N.222=(|N12-N21|-1) 2/(N12+N21),顯著性差異 ( )自由度（ df）=1靈敏度（ p+， %）p+=N11/N1.特異性（ p-， %）p-=N22/N2.假陰性率（ pf-， %）pf-=N12/N1.=100- 靈敏度假陽性率（ pf+ ，%）pf+=N21/N2.=100- 特異性相對準(zhǔn)確度， %c（ N11+N22 ） /(N1.+N2.)注：a 由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果；b 由待確認(rèn)方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認(rèn)后的結(jié)果。用于確認(rèn)方法時，結(jié)果2.5mg/kg 時，判定為陽性（僅用于計算性能指標(biāo)）；c 本方法規(guī)定：用于計算靈敏度和假陰性率的陽性樣品，由參比方法檢驗得到的結(jié)果范圍應(yīng)在 2.5 10mg/kg 之間。N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標(biāo)指行，第二個下標(biāo)指列。例如： N 11 表示第一行，第一列， N1.表示所有的第