發(fā)酵工程制藥二

1、第九節(jié) 基因工程在發(fā)酵工程中的應(yīng)用以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)發(fā)展藥物的方法獲得新型結(jié)構(gòu)和生物活性的抗生素變得越來越難一. 自然分離合成步驟繁多、合成產(chǎn)率低下二. 化學(xué)合成基因工程改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)體現(xiàn)在四個方面直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。菌種選育突變、體內(nèi)重組、體外重組（基因工程）一、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需的產(chǎn)物，只有經(jīng)過進(jìn)一步的人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn)微生物基因工程育種 這是一種自覺的、能像工程一樣事先設(shè)計和控制的育種技術(shù)，可以完成超遠(yuǎn)緣雜交，是最新最有前途的育種方法。 （一） 抗生素生物合成基因的特點及其克隆的策略和方法 在已知的微生物所產(chǎn)生的抗生素中，約23

2、由放線菌產(chǎn)生，而其中的80來源于鏈霉菌；鏈霉菌屬中的鏈霉菌，有約500個種。阿克拉霉素Aclacinomycin 目前用于治療急性白血病(Leukemia)與淋巴瘤(Lymphomas)有良好療效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomyces galilaeus 合成的聚酮類化合物，其合成酶的生物合成涉及13個基因，緊密成簇排列。返回7個利用質(zhì)粒和噬菌體載體來克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用這些策略已經(jīng)克隆了不同類型抗生素的生物合成基因。這7個方法是：在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物阻斷變株法阻斷變株法突變克隆法突變克隆法直接

3、克隆法直接克隆法克隆抗生素抗性基因法克隆抗生素抗性基因法寡核苷酸探針法寡核苷酸探針法同源基因雜交法同源基因雜交法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略略 放線紫紅素是由天藍(lán)鏈霉菌合成的多酮肽抗菌素,大約通過16個步驟合成； 對76個阻斷突變體(act -)進(jìn)行互補測驗研究， Rudd和Hopwood將它們分成7個組，每組代表在不同的生物合成步驟發(fā)生損傷。 Act和act 不能與其它突變株互補，說明這兩個突變發(fā)生在放線紫紅素生物合成的最早期的步驟中； 用pIJ922質(zhì)粒從act 菌株中克隆了一個 BamH25 bp片段，可以與除act 外的其它阻斷株互補； 用基因克隆的方法，將a

4、ct+菌株中相當(dāng)大的DNA片段(1530 kb)克隆到載體pJJ922上，組建成重組質(zhì)粒pJJ2303，它能互補所有7組act -突變株，并能使不產(chǎn)生任何一類多酮肽抗菌素的小小鏈霉菌合成放線紫紅素。這個片段顯然是放線紫紅素生物合成全部基因組成的基因簇。放線紫紅素阻斷突變株之間的互補測驗前體 中間產(chǎn)物2中間產(chǎn)物14中間產(chǎn)物15中間產(chǎn)物1放線紫紅素actactact act actactact act act act act act 【突變克隆法原理圖解突變克隆法原理圖解】 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 62255氨基糖苷類抗生素生物合成是由初級代謝產(chǎn)物經(jīng)過一系列酶催化產(chǎn)生的次級代謝

5、產(chǎn)物，其形成是一個復(fù)雜的，多因素的調(diào)節(jié)過程，抗生素的生物合成基因簇構(gòu)成了對抗生素產(chǎn)生的最低水平的調(diào)節(jié)和控制。1. 1.放線紫紅素放線紫紅素2.2.紅霉素紅霉素3.3.青霉素青霉素4.4.鏈霉素鏈霉素（二） 幾種典型的抗生素生物合成基因簇的結(jié)構(gòu)（三） 提高抗生素的產(chǎn)量（三） 提高抗生素的產(chǎn)量（三） 提高抗生素的產(chǎn)量act (編碼聚酮合成酶 ketosynthase, KS和鏈長決定子 chain length determining, CLF) ；act (編碼酮基還原酶 ketoreductase, KR)（三） 提高抗生素的產(chǎn)量1.生物合成途徑中某個酶基因的突變2.在生物合成途徑中引入一個酶

6、基因3.利用底物特異性不強的酶催化形成新產(chǎn)物有針對性地對某些基因進(jìn)行操作，如替換、阻斷、重組等均有可能改變其生物合成途徑而產(chǎn)生新的代謝旁路，形成新的化合物。組合生物合成的基本過程是將不同來源的基因組合，在異源宿主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)，將宿主細(xì)胞產(chǎn)生的化合物分離提純，對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，推測生物合成規(guī)律。組合生物合成的特點二二、基因工程在氨基酸和維生素生產(chǎn)中的應(yīng)用基因工程在氨基酸和維生素生產(chǎn)中的應(yīng)用 在氨基酸生產(chǎn)中的應(yīng)用酶法生產(chǎn)氨基酸工藝中，主要是通過克隆某些酶系基因來生產(chǎn)氨基酸。如，把色氨酸合成酶基因與絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶基因與質(zhì)粒載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用于酶法生產(chǎn)L-色氨酸。賴氨酸和蘇氨酸協(xié)

7、同反饋抑制賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同反饋抑制互補試驗原理圖示互補試驗原理圖示 A+ B A B+ A+ B A B+ 突變型 屬同一順反子野生型 屬不同順反子反式: A+ B+ A B反式:順式:野生型 順反效應(yīng)順反效應(yīng)（cis-trans effect）順式排列（cis）： 兩個擬等位基因在同一條染色體上，另一條同源染色體的相對位置上排列著野生型基因，表現(xiàn)為野生型。反式排列（trans） 兩個擬等位基因分別位于兩條同源染色體上（野生型基因也位于兩條不同同源染色體上），使兩條染色體都是有缺陷的，表現(xiàn)為突變型。如果表現(xiàn)為野生型，則兩個擬等位基因分別就是兩個基因。順反測驗圖解順反測驗圖解A b1 A b2 a1 BA b2MutantWild type 不同的非等位基因 同一等位基因 功能互補效應(yīng)的測驗體系具有 不具有 突變位點 處于 同舟共濟(jì)愛莫能助現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)體現(xiàn)在哪四個方面？2、3、簡要說明以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)發(fā)展藥物的方法獲得新型結(jié)構(gòu)和生物活性的抗生素變得越來越難一. 自然分離合成步驟繁多、合成產(chǎn)率低下二. 化學(xué)合成直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。菌種選育突變、體內(nèi)重組、體外重組（