植物DNA的提取與鑒定

1、 圣誕快樂！圣誕快樂！ 第第7 7組組 組員：組員：楊曼楊曼、楊芳、朱晨楊芳、朱晨實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模赫莆照莆誄TABCTAB法從植物葉片提取法從植物葉片提取DNADNA的原理和方的原理和方法法掌握紫外光照射法鑒定掌握紫外光照射法鑒定DNADNA的原理和方法的原理和方法實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容：采用采用CTABCTAB法從植物葉片中提取法從植物葉片中提取DNADNA。采用紫外光照射法鑒定采用紫外光照射法鑒定DNADNA 1 1. .核酸是生物有機體中的重要成分，在核酸是生物有機體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以以核核蛋白蛋白的形式存在。的形式存在

2、。 在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，使和細胞膜，使核核蛋白被釋放出來。蛋白被釋放出來。 2 2. .CTABCTAB(hexadecyltrimethylammonium (hexadecyltrimethylammonium bromide,bromide,十六烷基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨) )，是一，是一種陽離子去污劑種陽離子去污劑, ,具有從低離子強度溶液具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中子強度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB(0.7mol/L NaC

3、l),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復合物，只是不能與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸沉淀核酸. .通過有機溶劑抽提，去除蛋白、通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。核酸分離出來。 （CTABCTAB法的全稱法的全稱是十六烷基三甲基溴化銨法是十六烷基三甲基溴化銨法（Hexadecyltrimethy Ammonium BromideHexadecyltrimethy Ammonium Bromide）。）。實驗試劑實驗試劑 CTABCTAB提取緩沖液提取緩沖液 洗滌緩沖液洗滌緩沖液：( (76%76%乙醇，乙醇

4、，10mmol/L10mmol/L乙酸銨乙酸銨共共100ml100ml：76mL76mL無水乙醇，無水乙醇，0.077g0.077g乙酸銨，乙酸銨，加水到加水到100mL100mL) ) T E T E 緩 沖 液緩 沖 液 ( 1 0 m m o l / L T r i s - H C L ( 1 0 m m o l / L T r i s - H C L （pH7.4pH7.4），），1mmol/L EDTA )1mmol/L EDTA ) 氯仿氯仿- -異戊醇異戊醇（24 24 ：1 1） 70% 70% 乙醇乙醇 液氮液氮實驗器材實驗器材冷凍高速離心機冷凍高速離心機臺式高速離心機臺式高

5、速離心機移液器移液器水浴鍋水浴鍋 37100 37100 陶瓷研缽陶瓷研缽離心管離心管 50ml 50ml，有蓋，有蓋 離心管離心管 5ml 5ml和和1.5ml 1.5ml 小玻棒小玻棒 形狀為彎成鉤狀的形狀為彎成鉤狀的 天平天平 1 1 ，將，將10mLCTAB10mLCTAB提取緩沖液加入提取緩沖液加入50mL50mL離心離心管管中，置于中，置于6060水浴水浴中預熱。中預熱。2 2 ，稱取，稱取1.5g1.5g葉片，置于預冷的葉片，置于預冷的研缽研缽中，中，倒入液氮，盡快將葉片研碎至成粉末。倒入液氮，盡快將葉片研碎至成粉末。3 3 ，取，取1g1g粉末直接加入預熱的粉末直接加入預熱的C

6、TABCTAB分離緩分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻。沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻。4 4 ，將磨碎液分倒入將磨碎液分倒入1.5 ml1.5 ml的滅菌離心管的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二；中，磨碎液的高度約占管的三分之二；5 5，置于，置于6565的水浴槽或恒溫箱中，每隔的水浴槽或恒溫箱中，每隔10 min10 min輕輕搖動，輕輕搖動，3060min3060min后取出；后取出； 6 6，冷卻，冷卻2 min2 min后，加入氯仿后，加入氯仿- -異戊醇（異戊醇（2424：1 1）至滿管，充分混勻至滿管，充分混勻23 min23 min7 7，放入離心機中，放入離心機中10000

7、rpm10000 rpm離心離心10 min10 min，與此，與此同時，將同時，將600 ul600 ul的異丙醇加入另一新的滅菌離心的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；管中； 8 8， 10000 rpm 10000 rpm離心離心1 min1 min后，移液器輕輕地吸后，移液器輕輕地吸取上清液，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心取上清液，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動管慢慢上下?lián)u動30 s30 s，使異丙醇與水層充分混合，使異丙醇與水層充分混合至能見到至能見到DNADNA絮狀物；絮狀物；9 9，10000 rpm10000 rpm離心離心1 min1 min后，立即倒掉液體，

8、注意勿將后，立即倒掉液體，注意勿將白色白色DNADNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上； 10, 60 s 10, 60 s后，直立離心管，加入后，直立離心管，加入720ul720ul的的75%75%乙醇及乙醇及80 80 ul 5 Mul 5 M的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的底的DNADNA塊狀物浮游于液體中；塊狀物浮游于液體中； 11 11，放置，放置30 min30 min，使，使DNADNA塊狀物的不純物溶解；塊狀物的不純物溶解； 12 12，10000 rpm10000 rpm離心

9、離心1 min1 min后，倒掉液體，再加入后，倒掉液體，再加入800 800 ul 75%ul 75%的乙醇，將的乙醇，將DNADNA再洗再洗 30 min 30 min； 13 13，10000 rpm10000 rpm離心離心30 s30 s后，立即倒掉液體，將離心管后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNADNA（自然風干或用風筒吹干）；（自然風干或用風筒吹干）； 14 14，加入，加入50 ul 0.5 50 ul 0.5 TE( TE(含含RNase)RNase)緩沖液，使緩沖液，使DNADNA溶溶解

10、，置于解，置于3737恒溫箱約恒溫箱約15 h15 h，使，使RNARNA消解消解 紫外光照射法：紫外光照射法： 1 1配制染色劑。用蒸餾水配制萬分之五配制染色劑。用蒸餾水配制萬分之五的溴化乙錠（的溴化乙錠（EBEB）溶液。）溶液。 2 2將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上，再滴一滴紙上，再滴一滴EBEB溶液染色。溶液染色。 3 3將蠟紙放在紫外燈（將蠟紙放在紫外燈（260 nm260 nm）下照射）下照射（暗室中），可見橙紅色的螢光（暗室中），可見橙紅色的螢光（DNADNA的的紫外吸收高峰在紫外吸收高峰在280 nm280 nm處）。處）。 1，在在DNAD

11、NA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)： 化學因素，核酸的結(jié)構(gòu)在化學因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pHpH值值4.04.011.011.0間較穩(wěn)定，間較穩(wěn)定，pHpH值在此范圍外就會使核酸變性值在此范圍外就會使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。 物理因素，物理因素，DNADNA分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性。又有一定的剛性，故構(gòu)，既有一定的柔性。又有一定的剛性，故強機械作用如劇烈攪拌會令強機械作用如劇烈攪拌會令DNADNA分子斷裂，分子斷裂，不利于收集，

12、應(yīng)加以避免。不利于收集，應(yīng)加以避免。酶的作用，細胞中普遍存在的酶的作用，細胞中普遍存在的核酸酶核酸酶在細胞壁或膜遭到破壞時被釋放出來，在細胞壁或膜遭到破壞時被釋放出來，它會降解它會降解DNADNA分子。故須用酶的變性劑、分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫溫(0(0左右左右) )下進行。下進行。 ,2 2，所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。 1.1.用酚抽提細胞用酚抽提細胞DNADNA時，有什么作用？時，有什么作用？ 使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNaseDNase的降解作用。用苯酚處理勻漿

13、液時的降解作用。用苯酚處理勻漿液時, ,由于蛋白與由于蛋白與DNA DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷聯(lián)結(jié)鍵已斷, ,蛋白分蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于水相。溶于水相。 2.2.氯仿的作用？氯仿的作用？ 克服酚的缺點；加速有機相與液相分層?？朔拥娜秉c；加速有機相與液相分層。 最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的跡量最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）酚。（酚易溶于氯仿中）3.3.異戊醇的作用？異戊醇的作用？ 減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，