沙門氏菌的檢驗

1、沙門氏菌的檢驗食品學院14食品質(zhì)量與安全1班劉文敏 柳基煒 衛(wèi)杰恒 溫紫君201430520115 201430520116 201430520121 201430520122摘要：本實驗采用GB/T4789.4-2010的檢測方法測定雞場中的沙門氏菌。通過本實驗學習沙門氏菌的檢測方法和技術(shù)， 了解沙門氏菌的一些生化特性；本實驗 先用顯色培養(yǎng)基找出可疑菌落，再做生化試驗找出可疑的典型性的沙門氏菌， 再 通過血清學試驗最終確定是否為沙門氏菌屬。關(guān)鍵詞：沙門氏菌 接種 生化試驗 血清學鑒定、，.刖 百沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學中具有重要意義的人畜共患病種之一， 其病原沙門 氏菌屬于腸道細菌科。沙門氏菌

2、是一個統(tǒng)稱，泛指2000多種有緊密連系的細菌， 包括引起食物中毒，導致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌。雖然只有少數(shù)人因沙門 氏菌而患病，但是，在世界范圍內(nèi)的細菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引起的占大多數(shù)。因此，采用科學、合理的方法檢驗食品中沙門氏菌，已經(jīng)成為了人們 最關(guān)心的問題之一。國標法（GB4789.4-2010）是目前中國規(guī)定的食品中沙門氏 菌的標準檢測方法，也是基層實驗室普遍采用的檢測方法，它根據(jù)沙門氏菌的生 長特點和生化特性，采取前增菌、增菌、分離、生化試驗和血清學鑒定5個步驟進行o1材料與方法1.1 實驗材料1.1.1 儀器設(shè)備均質(zhì)器、三角燒瓶、平皿、玻璃棒、接種棒恒溫培養(yǎng)箱：36c

3、± rc, 42c ± 1C吸管：1 mL （具0.01 mL亥ij度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸頭精品 電子天平PL602-S,梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 SYQ-DSX-280B上海中安醫(yī)療器械廠1.1.2 試劑藥品雞腸、靛基質(zhì)試劑、沙門氏菌 O和H診斷血清、API20E生化試劑盒或VITEKGNI 生化鑒定卡1.1.3 培養(yǎng)基蛋白陳水（BPW/）四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（S。增菌液、亞硫 酸鈿（BS）瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白陳水、尿素瓊脂、氟化鉀、氟化 鉀對照、賴氨酸脫竣酶、賴氨酸脫竣酶對照

4、、甘露醇、山梨醇、B -D半乳糖甘（ONPG培養(yǎng)基1.2 實驗方法1.2.1 培養(yǎng)基的制備1.2.1.1 培養(yǎng)基的配制步驟蛋白陳水（BPW：稱取蛋白陳10g、氯化鈉5g、磷酸氫二鈉9g、磷酸二氫鈉1.5g、 蒸儲水1000ml,將各成分加入蒸儲水中，攪混均勻，靜置約 10 min,煮沸溶解， 調(diào)節(jié)pH,高壓滅菌121 C, 15 min。分裝10瓶，每瓶90ml四硫磺酸鈉煌綠（TTB：高壓滅菌121 C, 15 min滅菌冷卻后至30C,每100ml 基礎(chǔ)培養(yǎng)液加碘液2ml,煌綠液1ml1.2.1.2 配制培養(yǎng)基的注意事項（1）按照說明書上的用量進行換算，稱取準確分量的合成培養(yǎng)基粉末；（2）加

5、熱煮沸溶解培養(yǎng)基時，留意鍋內(nèi)水位的變化，水位下降可再添加適量的水，以免水分蒸發(fā)過多，導致后面分裝不夠量；（3）往試管中放小導管時，注意處理氣泡。1.2.2沙門氏菌群檢測1.2.2.1 沙門氏菌檢測程序精品2沙門氏菌檢測操作步驟精品2.1 前增菌稱取10 g （mD樣品放入盛有90 mLBPW勺無菌均質(zhì)杯中，以8 000 r/min 10 000 r/min 均質(zhì)1 min2 min ,或置于盛有90 mL BPW勺無菌均質(zhì)袋中，用 拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min。使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36 C±1 C 培養(yǎng)8 h18h。2.2 增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取 1

6、mL,轉(zhuǎn)種于10mL TTB內(nèi)，于42 C ±1C培養(yǎng)18h24h0同時，另取1mL轉(zhuǎn)種于10mL SC內(nèi)，于36C ± 1C培養(yǎng) 18 h 24h。2.3 分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個HE瓊脂平 板。于36c ±1C分別培養(yǎng)18 h24 h （HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基 平板） 或40h48h （BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落，各個平板上 的菌落特征見表1表1沙門氏菌屬在不同選擇性隙脂平板上的南落畤征法擇性焦脂平板沙門氏前BS琮脂崩落為騫魚有金屬光電粽褐色或灰包國落周用培養(yǎng)基可呈,色或驚色有些 菌株形成想色的窗

7、落周周培姆不受.HE琮脂盜球色或/&多裁菌落中心翳包或幾乎全需色有些窗侏為黃色中心第色戢 JL乎全雪仇XLDO富常呈杼圻£帶或不密曇色中心自些好一可呈現(xiàn)大的帶光糖的再色亡3或 以無全部思色的麟；有咎茵收為黃色菌落或不常黑色中心.沙i氏南前色培林按照顯色焙養(yǎng)基的舸進肚底2.4 生化試驗2.4.1 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂， 先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫竣酶試驗培 養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36C ±1C培養(yǎng)18h24h,必要時可延長至48h。在三 糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗

8、培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應結(jié)果見表2。精品表2沙門氏菌屬在三精珍壇雷為賴氨酸脫段甄試騎培養(yǎng)基內(nèi)的反應菇果三度翔第梭引教股控裝討配格第甚初步刪制同底層產(chǎn)氣晚化星KA+ (-)+ (-)+砒處n氏兩屬KA+ (-)+ (-)可疑沙門氏菌屬AA+ (-)+ (-)可疑眇門氏0AA+/一+/羊沙口氏腐Kk+ / 一+/:涉n扉生l產(chǎn)誠.生產(chǎn)續(xù)陽性，-：用性：+ r 多粒陽性，少依陰性2 + -：汨性或用性，在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時賴氨酸脫竣酶試驗陰性的菌株可以排除。其他的反應結(jié)果均有沙門氏菌屬的可能， 同時也均有不是沙門氏菌屬的 可能。2.4.2 系列生化反應試驗接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫

9、竣酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白陳水（供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氟化鉀（KCN培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36c ± 1 C培養(yǎng)18 h24 h ,必要時可延長至48h,按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲存于2c5c或室 溫至少保留24h,以備必要時復查。13沙門氏誨屬生化反應初步鑒別表反應序號硫化氫 （H2S）靛基質(zhì)pH 11尿素鼠化仰（KCM核氨酸脫發(fā)醒A1f+A2+A3/ 由+陽性；-陰性；+/-陽性或陰也2.4.3 反應序號A1 :典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫竣酶3項中有1項異常，按表4可判定為沙門

10、氏菌，如有2項異常為非沙門氏菌。精品表沙門氏南屋生化反應初步鑒別表pH U尿索裂化號KCX）賴氨酸 m.二.<網(wǎng)副凌沙門氏南陵求端學鑒定緒果）一M氏菌IV或"要求符合本群生化特性）+沙門氏酊利變體I妾求端學凝結(jié)果）注標幣生+表示陰也2.4.4 反應序號A2:補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項 試驗結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學鑒定結(jié)果進行判定。2.4.5 反應序號A3:補做ONPG ONPG1性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫竣酶陽 性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫竣酶陰性。2.4.6 必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氐藺屬各生化群的鑒力項口IHIIIIV

11、VX工才醉+山梨醵+水暢育一+一ONPG+丙二疊起+KCN+注，+表示陽性;一表示圉性C2.5 血清學鑒定滴一定生理鹽水在載玻片靠近磨砂的一邊作對照，在另外一邊滴一滴血清，用滅菌后的接種環(huán)從三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面取一點菌種， 放進血清中，然后用酒 精燈將接種環(huán)滅菌冷卻后，再取少量菌種放進生理鹽水中。觀察血清中的的菌落 是否凝結(jié)，與生理鹽水中的菌落對比。2.6 結(jié)果與報告精品綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結(jié)果，報告 25 g （mD樣品中檢出或未檢 出沙門氏菌。3實驗結(jié)果與分析3.1.1 沙門氏菌檢測現(xiàn)象和結(jié)果（見表 7）表7沙門氏菌檢測現(xiàn)象和結(jié)果試齊硫化氫蛋白陳（加 靛基質(zhì)）尿素氟化鉀賴氨酸脫

12、竣酶現(xiàn)象黑色/、父色桃紅色不渾濁綠色結(jié)果+-+-+注：+陽性，-陰性3.1.2 實驗結(jié)果分析對照沙門氏菌生化反應初步鑒定表， 尿素，氟化鉀，賴氨酸脫竣酸三項中有 兩項異常，按沙門氏菌生化鑒定表可判定結(jié)果為非沙門氏菌屬03.1.3 甘露醇和山梨醇試驗現(xiàn)象和結(jié)果甘露醇和山梨醇都變成黃色，表現(xiàn)為陽性。需要補做血清學鑒定試驗。3.1.4 OPNG試驗現(xiàn)象和結(jié)果OPN變成深黃色，表現(xiàn)為陽性，為非沙門氏菌屬。3.2.1 血清學鑒定實驗現(xiàn)象和結(jié)果血清中的菌落沒有出現(xiàn)凝結(jié)現(xiàn)象，與生理鹽水中的菌落現(xiàn)象一樣。3.2.2 實驗結(jié)果分析血清學鑒定結(jié)果為該菌落為非沙門氏菌屬。4實驗結(jié)論與討論結(jié)論：綜合以上生化試驗和血清

13、學試驗的結(jié)果，25g樣品中未檢出沙門氏國局。討論：沙門氏菌是重要的腸道致病菌，腸炎沙門氏菌是其中的一種，常引 起雞、鴨等禽類感染，還可引起食物中毒2,但是實驗結(jié)果顯示為非沙門氏菌屬， 可見實驗結(jié)果的正確性可信性不高，實驗過程中可能存在操作失誤（如接種環(huán)還 未冷卻就取種，導致菌種死亡）或者其他原因?qū)е聦嶒炂?，應該重新做實驗?嚴格按照國標再次進行試驗，提高實驗的準確性和可信度。鑒于雞肉等畜禽產(chǎn)品精品 污染沙門氏菌所引起食源性疾病的風險，越來越多的學者投入到其生產(chǎn)加工環(huán)節(jié) 的溯源研究中。傳統(tǒng)的血清學方法由于存在著抗原的變異及不同種屬菌間的交叉 反應等，其應用受到了一定限制精品網(wǎng)。而ERIC-PCR技術(shù)具有操作簡便、重復性強，靈敏度高、鑒別能力強、 所需儀器設(shè)備簡單、成本低等優(yōu)點，成為細菌基因分型、流行病學調(diào)查研究領(lǐng)域 里強有力的工具4。.5檢驗報告報告陰性結(jié)果：25g樣品中未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌。參考文獻1陳玲.食品中沙門氏菌檢驗方法的研究J.科技與創(chuàng)新，2015,8.2孫園園，趙鵬等.沙門氏