白膜法手工富集血小板與單供者機采血小板質量對比研究

1、白膜法手工富集血小板與單供者機采血小板質量對比研究    【摘要】 本研究旨在對比白膜法手工富集血小板與單供者機采血小板的質量差異。將15袋（2單位/袋，400 ml全血制備）白膜法手工富集血小板和15單位單供者機采血小板在（22 ±2 ）條件下振蕩保存。在制備后1小時檢測血小板濃度、體積、白細胞殘留量、紅細胞殘留量；分別在血小板保存的0、1、2、3、4、5天檢測平均血小板體積、pH值、乳酸濃度、血小板膜表面CD62p表達率、凝血酶激活后CD62p再表達率、血小板低滲休克反應。結果顯示：二組的血小板得率、紅細胞殘留量、白細胞殘留量都分別達到相應

2、的國家質量標準，但在達到相同血小板計數的情況下，白膜法手工富集血小板組的紅細胞殘留量、白細胞殘留量明顯高于單供者機采血小板組（p0.01）；二組的乳酸、血小板膜表面CD62p表達率均隨保存時間延長而升高；二組間比較，白膜法手工富集血小板組CD62p表達率在保存0-5天均高于單供者機采血小板組（p0.01）。二組的pH值、凝血酶激活后CD62p再表達率均隨保存時間的延長而下降；二組間比較，2-5天白膜法組pH值明顯低于單供者機采血小板組（p0.01），0-5天白膜法組CD62p再表達率明顯低于單供者機采血小板組（p0.01）。單供者機采血小板組血小板低滲休克反應水平在0-5天無明顯變化，而白膜法

3、手工富集血小板組血小板低滲休克反應水平隨保存時間的延長而下降，保存1-5天時均明顯低于單供者機采血小板組（p0.01）。結論：白膜法手工富集血小板質量低于單供者機采血小板質量，其制備工藝有待改進和優(yōu)化，以降低紅細胞、白細胞殘留量和活化血小板水平，提高其血小板質量。    【關鍵詞】 單供者機采血小板    Qualitative Comparison between Buffy?Coat?Collected Platelet Concentrates and those by Single?donor Platel

4、etapheresis    Abstract    This study was aimed to compare the difference of quality between buffy?coat?collected platelet concentrates (BC?PC) and single?donor plateletapheresis (SDP). 15 packs of BC?PC and 15 units SDP were stored at 20-24 with agitation. Pl

5、atelet concentration， platelet volume, residual leukocyte and residual erythrocyte in two groups were examined after preparation for 1 hour. Mean platelet volume, pH value, hypotonic shock response (HSR) , CD62p expression and CD62p re?expression of platelet were detected on 0, 1, 2, 3, 4, 5 days of

6、 platelet preservation. The results showed that the platelet yields, residual leukocyte and residual erythrocyte in two groups accorded with the national quality standard respectively, but residual leukocyte and residual erythrocyte in BC?PC group were higher than those in SDP group when platelet yi

7、elds in two groups were equal（p0.01）. Lactate concentration, CD62p expression of platelet increased with prolongation of preseved time, while pH value decreased gradually. Compared with SDP group, there were significant differences in CD62p expression, CD62p re?expression of platelet preserved for 0

8、-5 days（p0.01）, and in pH value of platelet preserved 2-5 days（p0.01）.There was no changes in HSR of SDP group for 0-5 days, while HSR in BC?PC group decreased gradually. There were significant differences in HSR of platelet preserved for 1-5 days（p0.01）. It is concluded that the platelet concentrat

9、es prepared by BC?PC are not equal to SDP in quality, the preparation technology of BC?PC should be optimized further in order to reduce residual leukocyte, residual erythrocyte and activated platelet yields, as well as improve the quality of BC?PC.    Key words   

10、 single?donor plateletpheresis; buffy coat; hypotonic shock response; CD62p    J Exp Hematol 2007; 15(4):878-881    隨著全自動血細胞分離機在國內的普及推廣，我國單供者機采（單采）血小板的用量逐年上升，而手工白膜采集的血小板在臨床的應用越來越少，造成手工采集全血中血小板資源的嚴重浪費。而在歐洲，手工采集的血小板始終占血小板用量的大多數。    國家衛(wèi)生部

11、決定自2006年9月30日起，一律停止有償單采血小板。因此臨床供應的單采血小板數量顯著下降，手工制備濃縮血小板的用量穩(wěn)步上升。目前國內多數血站提供的濃縮血小板是采用白膜法手工制備，我們對白膜法手工富集血小板與單采血小板的質量與保存效果進行對比研究，為改進手工采集濃縮血小板工藝和建立全面質量標準提供依據。    主要儀器與應用試劑    MCS 血細胞分離機和995E采集保存袋（美國血液技術公司產品），四聯(lián)血液采集保存袋（廣州華南醫(yī)療用品有限公司產品），Heraeus 6000i 低溫離心機（德國賀利氏儀器公司產品）

12、，MEK?6180 K 型血細胞計數儀（日本Nikonkohden 公司產品）,VITROS 950干化學全自動生化分析儀(美國強生公司產品)，FACSCalibur 流式細胞儀(Becton Dickinson產品) 和CellQuest 分析軟件，APACT2聚集儀（四川美生實業(yè)有限責任公司產品），血小板振蕩保存箱（美國Forma公司產品），HI9321 微電腦型pH 計(Hanna 公司產品)，37恒溫水浴箱（北京長安科學儀器廠產品），Negeotee 血細胞計數池（Hausser Scientific Horsham, USA產品）,普通光學顯微鏡（日本Olympus公司產品）?？笴D

13、61 抗體: PerCP 標記(Becton Dickinson產品)；抗CD62p 抗體: RPE 標記( PharMingen公司產品)；人凝血酶: 0.5 U/ ml (Sigma公司產品)； Gly?Pro?Arg?Pro 乙酸鹽( GPRP) : 25 mmol/ L ( Sigma 公司產品)；改良TBS緩沖液: (NaCl 137 mmol/ L; KCl 2. 8 mmol/ L; MgCl21 mmol/L; NaHCO3 12 mmol/ L)； HEPES液1 mol/L。    血小板的制備與保存   

14、; 選擇符合國家獻血標準的健康獻血者30名，外周血血小板計數均大于1.5×1011/L，采血前1周未服用阿司匹林、消炎痛等已知對血小板功能有影響的藥物，其中15名使用四聯(lián)血袋(ACD?B抗凝劑)采集全血400 ml。全血在采集后的6小時內制備成濃縮血小板。制備流程：使用Heraeus 6000i 低溫離心機，第1次 1861×g 離心16分鐘，把上層血漿分出200 ml至血漿袋，分約50 ml血漿至轉移袋，再擠出20 ml混有紅細胞的白膜層，血漿沖管至終體積約90 ml；第二次 391×g 離心6分鐘；分出上層富血小板血漿50-70 ml（記為2單位）至

15、第四聯(lián)袋（PVC血小板專用保存袋），下層紅細胞丟棄。另15名獻血者使用MCS 血細胞分離機、995E保存袋采集血小板和ACD?A抗凝劑，單采容量為250-270 ml，血小板記數大于2.5×1011/單位。將所得濃縮血小板和單采血小板均置于血小板振蕩保存箱內，于22±2振蕩保存，振蕩頻率為60次/分鐘。    樣本的制備和處理    將濃縮血小板和單采血小板輕搖混勻后，在無菌操作臺上留取樣品至2支塑料試管中；將其中1支試管以 1007×g 離心10分鐘后取其上清液即為乏血小板血漿（PP

16、P），用PPP與另一支試管中的血小板以（1-3）1的比例混合配制成濃度為（3-4）×1011/L的富血小板血漿（PRP）待用。    血小板產品中的血小板、紅細胞測定    將稀釋后PRP混勻后用MEK?6180 K型血細胞計數儀測定血小板量、MPV及RBC。實際血小板數= 血小板計數/ L ×稀釋倍數 ×血小板容量(L)；每袋血小板中紅細胞數=紅細胞計數/ L ×稀釋倍數 ×血小板容量(L)。    血小板產品的白細胞計數&

17、#160;   用Negeotee血細胞計數池計數白細胞, 取100 l混勻的血小板樣品與400 l白細胞稀釋液混合10分鐘,充池,然后將計數池置于附濕濾紙的培養(yǎng)皿內加蓋,靜置20分鐘后將計數池置于200倍雙目顯微鏡下計數白細胞。每袋血小板中白細胞混入量= 白細胞數/ L ×血小板容量。    pH值、乳酸的測定    采用無菌注射器留取血小板樣品2 ml，1 ml立即上HI9321微電腦型pH 計測定pH值，而另1 ml用VITROS 950干化學全自動生化分析儀測定乳酸濃

18、度。    低滲休克反應測定（HSR）1，2    APACT2聚集儀開機、預溫, 將等滲PBS 緩沖液和低滲去離子水置于聚集儀預溫孔內預溫。使用HI9321 微電腦型pH 計測定PRP的pH之后，并用1.0 mol/L的HEPES液調節(jié)PRP的pH約為7.0。預溫完成后，在1測試杯中加入200 l PPP, 置于測試孔中設定PPP值后取出, 在另1測試杯中加入200 l PRP, 放入攪拌棒后插入測試孔中設定完PRP值后, 取200 l 等滲PBS 緩沖液迅速注入此測試杯中, 立即啟動檢測, 并記錄聚集儀在0.

19、5分鐘時的透光率，記為TPBS; 用低滲去離子水代替等滲PBS 緩沖液重復以上操作, 并記錄凝集儀在4分鐘內的最大透光率及4分鐘時的透光率，分別記為TMAX和T4min。    HSR=（TMAX-T4 min）/（TMAX-TPBS）×100%    血小板CD62p的陽性率與凝血酶激活后CD62p再表達率測定    在FCM專用試管中依次加入PRP，2.5 mmol/ L的GPRP、CD61、CD62p 各5 l，TBS 35 l，輕輕搖勻后室溫避光孵育15分鐘

20、；CD62p再表達率測定時，在加入CD62p之前需加入0.5 U/L的人凝血酶，混勻后再加CD62p 5 l，TBS 30 l，37避光孵育15分鐘。加入4 1%的多聚甲醛500 l，避光固定15分鐘，24小時內進行FCM分析。對照設定：單純血小板對照，單染PerCP標記抗CD61抗體對照，單染RPE標記抗CD62p抗體對照，用于調補償。CD62p再表達率=凝血酶激活后CD62p的陽性率-CD62p的陽性率。    統(tǒng)計學處理    所得數據以平均數±標準差（±SD）表示，各參數差異比較用配對t

21、檢驗。    結    果    兩組血小板制備后常規(guī)質量指標檢測    結果見表1。兩組血小板均分別達到了國家質量標準。12單位手工制備濃縮血小板相當于1單位單采血小板，血小板總數與單采血小板組比較無顯著差異（p0.05），而白細胞殘留總數、紅細胞殘留總數、血小板總容量明顯高于單采血小板組（p0.01）。    兩組血小板液態(tài)保存過程中代謝、功能指標的變化   &#

22、160;結果見表2。隨著保存時間的延長，兩組的乳酸濃度均逐漸增高，pH值逐漸下降；2組間比較，0-5天乳酸濃度均無顯著差異，0-1天pH值無顯著差異，2-5天白膜法組pH值低于單采血小板組（p0.01）。2組的MPV均隨保存時間延長而增大，在0-4天兩組間無顯著差異，第5天白膜法手工富集血小板組的MPV明顯高于單采血小板組（p0.05），單采血小板在整個保存期間HSR無明顯變化，白膜法手工富集血小板組第2天開始出現明顯下降，與單采血小板組比較差異顯著（p0.01）。隨保存時間的延長，CD62p表達率不斷升高，CD62p再表達率不斷下降，2組間比較差異顯著（p0.01）。  

23、  討    論    單采血小板的國家質量標準為每單位單采血小板的血小板計數2.5×1011，白細胞混入量5×108，紅細胞混入量8×109；手工制備濃縮血小板血小板計數4.0×1010（2單位/400毫升全血制備），白細胞混入量5×108，紅細胞混入量2×1093。本實驗中的單采血小板與手工制備濃縮血小板均達到了相應的質量標準，但按照血小板計數計算，輸注12單位手工制備濃縮血小板才相當1單位單采血小板，而紅細胞殘留總數、白細胞殘留總

24、數、血小板容量則明顯要高于單采血小板（p0.01），引起輸血不良反應的幾率可能也會相應增大。    血小板在體外液態(tài)保存過程中，新陳代謝活動仍在不斷進行中，主要包括有氧代謝和糖酵解兩種途徑4。血小板的能量供應主要源于有氧代謝，其代謝終產物二氧化碳可以通過血小板保存袋擴散出去。糖酵解的終產物是乳酸和氫離子，無法通過保存袋擴散，氫離子被血漿中的碳酸氫鹽緩沖，但當乳酸達到20 mmol/L時，血漿的緩沖作用消失，導致pH值迅速下降5。因此，pH值作為血小板質量監(jiān)控的一項重要指標而被大多數血液機構采用。本研究中兩組血小板的pH值均隨保存時間延長而下降，但白膜法手

25、工富集血小板組pH值下降更明顯（p0.01），因而可能對其體外功能產生不利影響。    血小板CD62p，也稱P選擇蛋白，是血小板活化的重要標志物之一，CD62p表達率是目前可以有效預測血小板體內回收率和存活率的最佳指標6,7。歐陽錫林等8研究表明，凝血酶激活后CD62p再表    達率可以有效反應血小板保存過程中功能儲備的變化情況。本研究同時對兩種方法制備血小板制備后及保存過程中CD62p表達率及凝血酶激活后CD62p再表達率進行了監(jiān)測，結果隨保存時間的延長，CD62p表達率不斷升高，CD62p再表達率不斷下降，

26、究其原因可能主要是血小板儲存損傷所致。但白膜法手工富集血小板組CD62p表達率的基礎值明顯高于單采血小板組，而CD62p再表達率基礎值明顯低于單采血小板組，其原因可能是白膜法制備濃縮血小板過程中2次離心、擠壓白膜等制備工序造成血小板過度激活所致。    HSR是能反映血小板體內存活率的重要功能指標1，HSR的恢復率越高，血小板的形態(tài)與體積就越接近正常，血小板的功能就越好。本研究中兩組的MPV均隨保存時間延長而增大，在0-4天兩組間無顯著差異，第5天白膜法手工富集血小板組的MPV明顯高于單采血小板組；單采血小板在整個保存期間HSR無明顯變化，而在白膜法手工富集血小板組第2天開始出現明顯下降，與單采血小板組比較差異顯著。HSR的變化間接反映了血小板膜耗能被動轉運能力的變化，受保存介質中能量代謝水平、pH值的影響。pH值的下降可能造成能量代謝及血小板膜轉運系統(tǒng)酶活性下降，從而使血小板HSR能力降低。    綜上所述，白膜法手工富集血小板質量低于單采血小板質量，其制備工藝尚需進一步改進和提高，以降低紅細胞、白細胞的殘留率和活化血小板水平，全面提高手工制備濃縮