國家自然基金標(biāo)書終稿

1、報告正文（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）：1、項目的立項依據(jù)隨著機(jī)械通氣、表面活性物質(zhì)替代療法等新技術(shù)應(yīng)用，危重新生兒、尤其是早產(chǎn) 兒存活率已顯著提高。然而，長時間吸入高濃度氧，幸存者易發(fā)生肺部氧化應(yīng)激損傷。 目前，高氧肺損傷已成為發(fā)達(dá)國家NICU最為棘手的問題之一和嬰兒慢性肺疾病的最 常見形式。但高氧肺損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，更無有效的防治手段。因此深入 研究其發(fā)病機(jī)制，積極防治高氧肺損傷，具有優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)的戰(zhàn)略意義。高氧肺損傷是一個涉及許多細(xì)胞活動的復(fù)雜過程，可分為早期的組織損傷（彌散 性肺泡炎）和晚期的損傷后修復(fù)（肺間質(zhì)重構(gòu)）兩個過程。細(xì)胞外基質(zhì)（extra

2、cellular matrix, ECM）的重建參與了高氧肺損傷的整個病理過程，若ECM重建正常，則損傷完 全修復(fù)，肺結(jié)構(gòu)正常；若ECM重建紊亂，將導(dǎo)致肺纖維化。因此，ECM重建是關(guān)系高 氧肺損傷結(jié)局的關(guān)鍵因素。本實驗室在國內(nèi)外率先開展了對早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷中基 質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases , MMPs ）和其抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）表達(dá)的研究，已發(fā)現(xiàn)肺損傷時MMPs過度表達(dá)、MMPs/TIMPs 失衡是ECM重建紊亂發(fā)生纖維化的關(guān)鍵原因1（具體研究成果見研究基礎(chǔ)欄）。有 關(guān)MMP

3、s在高氧肺損傷中的作用已為少數(shù)國外學(xué)者所重視，但高氧肺損傷后ECM重建 過程中，引起MMPs過度增加的具體機(jī)制是什么本實驗室擬從MMPs的誘導(dǎo)劑和抑制劑 兩方面深入研究。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑（extracellular matrix metalloproteinase inducer, Emmprin）在上調(diào)MMPs表達(dá)中起關(guān)鍵作用。Emmprin是分子量為58KD的質(zhì)膜 糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不僅表達(dá)于正常組織，還表達(dá)于腫瘤組織如肺部 腫瘤細(xì)胞，提示Emmprin參與體內(nèi)生理及病理過程2。目前，少數(shù)文獻(xiàn)已證明，體 外Emmprin與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)

4、增加。進(jìn)一步研究表明， Emmprin在細(xì)胞表面與自身受體或MMP結(jié)合，激活胞內(nèi)MAPK p38信號通路，該途徑 激活促進(jìn)ECM降解3,4。但關(guān)于Emmprin/MAPK p38對MMPs調(diào)節(jié)的研究僅限于腫瘤細(xì)胞，有關(guān)高氧肺損傷后肺ECM重建過程中，Emmprin如何調(diào)控MMPs/TIMPs平衡, 目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報道。轉(zhuǎn)化生長因子 B (Transforming growth factor beta, TGF- P )在下調(diào) MMPs 表 達(dá)中起關(guān)鍵作用。研究證明TGF-B刺激可使肺成纖維細(xì)胞MMPs生成減少5。另有 研究發(fā)現(xiàn)，TGF-B抑制元件位于MMP-1基因啟動子區(qū)，嚴(yán)密調(diào)控MMP-

5、1在不同生理和 病理情況下的表達(dá)6。進(jìn)一步的研究表明，TGF-B對MMP-1的作用通過SMAD信號途 徑介導(dǎo)，該途徑激活可阻止ECM降解5。因此,推測TGF-B/SMAD對MMPs/TIMPs平 衡的調(diào)節(jié)可能是影響肺損傷后ECM重建的關(guān)鍵因素之一。有關(guān)高氧肺損傷后肺ECM重 建過程中，TGF-B如何調(diào)控MMPs/TIMPs平衡，目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報道。近年來對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，位于大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)膜上約50-L00nni大小的囊 性凹陷結(jié)構(gòu)一小窩(caveolae),是許多信號分子完成跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“驛站”。小窩 蛋白(caveolin)是小窩胞漿面包被的一種2L24kD的膜蛋白，是許多信號

6、分子活性 狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)者。在無胞外信號刺激下，caveolin通常與富集于小窩質(zhì)膜上的各種 信號分子、受體及非受體型酪氨酸激酶等相結(jié)合，抑制這些信號物質(zhì)的活性；在激動 劑與受體結(jié)合后，caveolin分子構(gòu)象發(fā)生變構(gòu)或共價修飾，調(diào)節(jié)信號物質(zhì)的活化狀態(tài), 參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控7。有關(guān)caveolin在肺ECM重建中的作用，有學(xué)者提出肺泡I型上 皮細(xì)胞caveolin表達(dá)缺失可能是發(fā)生肺纖維化的亞細(xì)胞指標(biāo)。對caveolin-1基因敲除 小鼠的研究，肺組織顯示肺泡隔因細(xì)胞增殖而增厚和肺纖維化。caveolin-la在肺發(fā)育 的不同階段，可表達(dá)于不同血管和上皮細(xì)胞，呈時相分布8。研究發(fā)現(xiàn)，caveol

7、in - 1與TGF-13 I型受體(TBR I )相互作用，抑制TGF-B介導(dǎo)的SMAD-2和下游分子的 磷酸化，從而調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)9。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信號傳導(dǎo)為 酪氨酸磷酸化依賴的MAPK p38途徑，申請者推測caveolin能與Emmprin相互作用， 調(diào)控Emmprin介導(dǎo)的MAPK p38和下游分子的磷酸化。簡圖如下：胞外信 caveolin + caveolin/Emmprin 作用Emmprin/K p38TGF-B /SMAD號刺激變構(gòu)活化一+caveolin/TB R-L作用信號整鏟調(diào)控肺ECM重建基于上述，申請者提出如下假設(shè)：高氧暴露下MMP誘導(dǎo)劑

8、/抑制劑失衡是高氧肺損 傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因。高氧暴露使質(zhì)膜小窩表達(dá)或功能異常，從而 影響Emmprin/MAPK p38和TGF-B/SMAD兩條信號通路整合，繼而導(dǎo)致MMPs增加，ECM 重建紊亂。本人所在的研究室屬呼吸系統(tǒng)疾病重點實驗室。多年來，本人一直致力于新生兒高氧 慢性肺損傷的研究，已成功建立了早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷的動物模型、掌握了支氣管肺泡 灌洗術(shù)、體外II型肺洵上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、核酸、蛋白分析等技術(shù)，并對抗氧 化酶、細(xì)胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制中所起 的作用進(jìn)行了較深入的研究，同時應(yīng)用地塞米松、維甲酸、人類

9、重組促紅細(xì)胞生成素、 EGb761進(jìn)行了抗氧化損傷的干預(yù)研究（見研究基礎(chǔ)欄）。這些理論研究和技術(shù)方法的積累 為本課題的開展奠定了堅實的基礎(chǔ)。本研究如能完成，可望為探索高氧肺損傷后肺ECM 重建紊亂的機(jī)制開拓新思路，并為尋找有效的預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供依據(jù)。參考文獻(xiàn)2、項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題。研究目標(biāo)：建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型，探討Emmprin與TGF-B調(diào)節(jié)失衡是否為高氧肺 損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因；探討小窩蛋白對BiuprimMAFKp38和像-P/SMW 兩條信號通路整合的影響，為高氧肺損傷發(fā)生機(jī)制和尋找有效防治措施提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容

10、：1. Emmprin/MAPK p38信號通路活化狀態(tài)及高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時間點肺組織中Emmprin、P38、磷酸化P38的表達(dá)。 研究高氧肺損傷Emmprin/MAPK P38信號通路活化狀態(tài)與MMPs表達(dá)雙變量關(guān)系。2. TGF- B /SMAD信號通路活化狀態(tài)及高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時間點肺組織中TGF-B、TBRI、SMAD、磷酸化SMAD的表 達(dá)。 研究高氧肺損傷TPRI的激酶活性，計算磷酸化SMAD與非磷酸化SMAD比值。研究高氧肺損傷TGF-B/SMAD信號通路的活化狀態(tài)與WPs/TIMPs的雙變量關(guān)

11、 系。3. caveolin-1對Emmprin/MAPK p38和TGF- B /SMAD兩條信號通路及其與高氧肺損傷所 致ECM重建紊亂的相關(guān)性：研究高氧肺損傷不同時間點肺組織中caveolin-1表達(dá)及酪氨酸磷酸化水平。 研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與Emmprin的共定位。 研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與TP R I的共定位。擬解決的關(guān)鍵問題：1 .成年動物急性高氧肺損傷模型，因其肺發(fā)育已成熟，不能如實反映不成熟肺的損傷情 況，并且與臨床上早產(chǎn)兒需長期用氧情況差異較大。本項目采用早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺 損傷模型，能更如實模擬支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生

12、情況。雖然此模型技術(shù)難度較大, 但本研究組在早產(chǎn)大鼠模型制備方面已積累了豐富經(jīng)驗，能成功完成此模型的復(fù)制。2 .本研究假設(shè)caveolin與Emmprin的相互作用可調(diào)控Emmprin/'MAPK p38信號通路活化: caveolin-1與T B R I的相互作用可調(diào)控TGF- P /SMAD信號通路活化。以往由于技術(shù) 條件限制，未能從形態(tài)學(xué)上直接證實。借助共聚焦顯微鏡觀察和熒光雙重標(biāo)記技術(shù)可 解決這一技術(shù)難題。3、擬采取的研究方案及可行性分析。研究方法：本課題采用共聚焦顯微鏡(confocal microscope)s免疫熒光雙重標(biāo)記和免疫組 織化學(xué)等研究方法，輔以蛋白質(zhì)與核酸分析

13、技術(shù)(Western Blot、Northern Blot方法)， 檢測各指標(biāo)的動態(tài)變化，并對各指標(biāo)進(jìn)行定位、定性、定量分析。1 .建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型：參照申請者著作，實用兒科臨床雜志，(1) .檢測caveolin-1酪氨酸磷酸化水平：應(yīng)用抗caveolinTpAb進(jìn)行免疫沉淀 應(yīng)用抗磷酸化酪氨酸mAb進(jìn)行Western Blot分析.檢測肺組織中Emmprin、P38、磷酸化P38、TGF-B、TGF-B I型受體(TPRI )及SMAD-2、磷酸化SMAD表達(dá)，探討高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的分子機(jī)制: 蛋白質(zhì)水平檢測一Western Blot。 mRNA 水平檢測一Nor

14、thern Blot （或 RT-PCR）。.檢測肺組織中TBRI的激酶活性： TBRI分離提取一免疫沉淀法（immunoprecipition） TBRI與純化的激酶底物GST-SMAD2 （由美國國立癌癥研究機(jī)構(gòu)de Caestecher, M教授提供）反應(yīng)，應(yīng)用免疫印跡法檢測磷酸化SMAD2水平，計算T BRI的激酶活性。.檢測肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin /Emmprin及caveolin-l/T R I的共定位及表 達(dá)：樣本制備：制備組織切片f加入抗caveolin mAb-PE標(biāo)記的二抗f加入抗Emmprin/T B R I 的 pAb-*FITC 標(biāo)記二抗共聚焦顯微鏡（TCS

15、SP型，德國Leica公司）檢測共定位；應(yīng)用圖象分析軟件對 caveolin表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量。.應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法處理數(shù)據(jù)：應(yīng)用SAS統(tǒng)計分析軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。技術(shù)路線:早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷模型caveolin酪氨酸磷酸化狀態(tài)（免疫沉淀、免疫印跡）TGF-P/S4AD信號通路研究Emmprin/MAPK )38信號通路研究Emmprin. P38、磷酸化 P38 TGF- P > TBR、SMAD、磷酸化 SMAD表達(dá)(免疫印跡與 Northern Blot 表達(dá)(Western Blot 和 Northern Blot)或 RT-PCR)TPRI激酶活性（免疫沉淀和免疫印跡）ca

16、veolin/Emprin 共定位caveolin/ TBR 1 共定位可行性分析：1 .申請者所在的研究室屬于呼吸系統(tǒng)疾病重點實驗室臨床二室，本室在慢性阻塞性肺疾 病和肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究領(lǐng)域已有大量工作積累，為本項目的研究打下了良好的 工作基礎(chǔ)。申請者及所在研究室在產(chǎn)兒高氧損傷領(lǐng)域進(jìn)行了一系列開拓性研究，已熟 練掌握急、慢性高氧肺損傷模型復(fù)制，蛋白、核酸分析等技術(shù)。（詳見研究基礎(chǔ)欄）2 .本項目研究的主要成員之一，香港合作者教授，是國際上新生兒肺損傷研究的前沿科 學(xué)家，目前與本研究小組密切合作，進(jìn)行有關(guān)慢性肺損傷研究?；籼┹x教授除承擔(dān)實 驗指導(dǎo)，并提供部分試劑。3 .新一代共聚焦顯微鏡具

17、有觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的立體定位功能，用其檢測在體組織 caveolin/Emmprincaveolin/ T B R I信號分子在亞細(xì)胞位點的共定位表達(dá)，雖無文 獻(xiàn)報道，在技術(shù)上難度較大，但申請者已掌握了多種熒光標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用共聚焦顯微 鏡觀察caveolin-1在細(xì)胞質(zhì)膜上的定位表達(dá)也已獲成功。申請人所在單位的醫(yī)學(xué)中 心的共聚焦顯微鏡和本實驗室的基本研究設(shè)備，能保證本實驗研究完成。4、本項目的特色與創(chuàng)新之處。理論上的創(chuàng)新：研究Emmprin/MAPK p38信號通路在器官發(fā)育和組織病理損傷中的作用，國內(nèi)外尚 無文獻(xiàn)報道。本課題研究caveolin對Emmprin/MAPK p38、TGF- P

18、/SNIAD共調(diào)節(jié)機(jī)制，將為早產(chǎn)兒 高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制開辟新的研究領(lǐng)域，并為其防治開拓新思路。方法上的創(chuàng)新：以在體組織為研究對象，應(yīng)用免疫熒光雙重標(biāo)記共聚焦顯微鏡技術(shù)研究 caveolin/Emmpriris caveolin/T B R I共定位，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報道，可望為深入研究 小窩蛋白對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制開辟新途徑。5、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果。年度研究計劃及預(yù)測進(jìn)展本課題研究內(nèi)容預(yù)計用3年時間完成.2004年1月8月購買所需試劑。建立預(yù)實驗動物模型。進(jìn)行各項預(yù)實驗。2004年9月。005年2月建立動物模型。完成標(biāo)本的收集。2005年3月7月完成MMPs、TIMPs、TGF-。、TB

19、RI、SMAD2及其mRNA表達(dá)的研究，并進(jìn)行階 段性總結(jié)。2005年8月2005年12月完成caveolin-1表達(dá)和caveolinT/T P R I共定位研究,并進(jìn)行階段性總結(jié)。2006年1月2006年6月完成caveolin-l的酪氨酸磷酸化狀態(tài)研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。2006年7月12月研究數(shù)據(jù)資料分析、總結(jié)、論文撰寫及成果鑒定。預(yù)期研究成果本項目所建立的早產(chǎn)新生大鼠慢性高氧肺損傷模型，不僅為本課題提供了研究對 象，而且為研究高氧肺損傷后肺ECM重建提供了模型。本研究可望為闡明早產(chǎn)兒高氧肺損傷機(jī)制提供新的線索：高氧暴露下MMP誘導(dǎo)劑/ 抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊

20、亂的主襄原因。高氧暴露使質(zhì)膜小窩 表達(dá)或功能異常，從而影響Emmprin/MAPK p38和TGF- B /SMAD兩條信號通路整合，繼而 導(dǎo)致MMPs增加，ECM重建紊亂。本研究內(nèi)容也可能為預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供理論依 據(jù)。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)1.與本項目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績本課題組多年來一直進(jìn)行高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治的研究，做了許多基礎(chǔ)和臨 床研究工作。已成功建立早產(chǎn)新生大鼠高濃度氧（85%95%）急性肺損傷和慢性肺纖維 化的模型；已完成肺組織中各種抗氧化酶活力、羥脯氨酸含量與肺纖維化的相關(guān)性研究； 內(nèi)源性一氧化氮在高氧肺損傷中雙重作用的研究；體外

21、高氧對肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-8 的影響研究；TGF-B在早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷肺組織中表達(dá)的研究；基質(zhì)金屬蛋白酶及其 抑制劑在高氧肺損傷中的作用機(jī)制的研究；及促紅細(xì)胞生成素、地塞米松、維中酸對新 生鼠高氧肺損傷的干預(yù)研究。獲獎?wù)n題目前正承擔(dān)的相關(guān)科研項目：1.2.相關(guān)研究工作發(fā)表的文章：附：基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用1.高氧組病理學(xué)改變2.高氧組MMPs表達(dá)圖1肺發(fā)育不良，示肺泡圖2細(xì)胞增生、間質(zhì)纖維圖3 MMP-2強(qiáng)陽性表達(dá)數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)簡單化改變3.酶譜法測BALF中明膠酶活性4.高氧暴露后MMPs、TIMPs表達(dá)增加MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-23d02±