奈米科技與DNA感應(yīng)器

1、奈米科技與DNA感應(yīng)器作者：隋安莉 嘉南藥理科技大學(xué)醫(yī)務(wù)管理系DNA感應(yīng)器的原理。近年來(lái)，由於生物科技的進(jìn)步，不斷地研發(fā)出許多新型生物檢測(cè)方法，其中用來(lái)檢驗(yàn)特定基因中去氧核醣核酸（DNA）序列的技術(shù)更是蓬勃發(fā)展。 所謂基因就是一段特定序列的DNA，以去氧核醣與磷酸酯為主要骨幹，並含有四種鹼基：腺嘌呤（A）、鳥(niǎo)糞嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）與胞嘧啶（C）。在兩條單股DNA之間，由於化學(xué)結(jié)構(gòu)的相互吻合，可藉由A與T，G與C之間形成特定的氫鍵而相互吸引，構(gòu)成雙股螺旋狀的DNA構(gòu)造。 科學(xué)家可由一股已知的DNA鹼基序列，推測(cè)出互補(bǔ)的另一股DNA鹼基序列。例如，一條DNA序列為AATTCGC，則其互補(bǔ)序列

2、就是TTAAGCG。當(dāng)二者序列完全吻合時(shí)，其間氫鍵吸引的力量最強(qiáng)；相對(duì)的，即使只有一個(gè)鹼基無(wú)法配對(duì)，就會(huì)使結(jié)合力減弱，在此種狀況下可以藉由增高溫度或是改變其所處溶液中的離子濃度，使錯(cuò)誤配對(duì)的DNA序列脫離。 在長(zhǎng)鏈DNA骨架中，以每三個(gè)鹼基為一密碼組，一個(gè)密碼組隱藏著一個(gè)特定胺基酸的信息。特定的基因在細(xì)胞核內(nèi)先轉(zhuǎn)錄成信使核醣核酸（mRNA），mRNA即可攜帶錄自DNA的訊息經(jīng)由核膜上的核孔到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，利用細(xì)胞質(zhì)中的核醣體轉(zhuǎn)譯合成出特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而執(zhí)行其在細(xì)胞中的生理功能而完成該基因的指令。有時(shí)即使僅有一個(gè)鹼基異於正常的基因序列，都有可能造成嚴(yán)重的生理缺陷。某些遺傳疾病，可藉由DNA的檢驗(yàn)早期

3、發(fā)現(xiàn)，及時(shí)治療。 科學(xué)家往往藉著此種DNA互補(bǔ)配對(duì)的特性，應(yīng)用於基因檢測(cè)上。簡(jiǎn)而言之，可先利用DNA合成儀製造一些特定的單股DNA序列，再藉由其互補(bǔ)配對(duì)的特性就能抓住欲檢測(cè)樣品中可與其配對(duì)的DNA序列。本文中介紹美國(guó)西北大學(xué)化學(xué)系莫金（Chad Mirkin）教授所領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)所發(fā)展的三種以奈米科技為基礎(chǔ)的DNA檢測(cè)方法，這些方法首次將奈米科技與DNA序列結(jié)合應(yīng)用於感應(yīng)器上，其敏感度與選擇性均有重大突破。 奈米的特性 所謂奈米是一種長(zhǎng)度的單位，而且是極為微小的一種單位。1奈米為10-9公尺，大約是10個(gè)氫原子的併排寬度，這可能還是無(wú)法提供具體的奈米概念。若以人類身體構(gòu)造為例，頭髮的平均直徑大

4、約在350微米左右，也就是說(shuō)約有350,000奈米，紅血球的直徑約為7,500奈米。 當(dāng)物質(zhì)以奈米級(jí)的大小存在時(shí)，不僅是體積的縮小，其導(dǎo)電性、磁性、電阻性、光學(xué)、物理及化學(xué)性質(zhì)也會(huì)有很大的改變。舉例來(lái)說(shuō)，這種DNA感應(yīng)器所利用的材料是金（Au）奈米粒子。在一般人的認(rèn)知中，黃金是黃色並帶有金屬色澤。但是，當(dāng)它以奈米大小的粒子形式存在時(shí)，光學(xué)性質(zhì)會(huì)因體積的極度縮小而有所改變，隨著粒徑的逐漸縮小，顏色的變化依序?yàn)辄S、橘（約100奈米）、綠（約50奈米）、暗紅（約13奈米）。不但如此，當(dāng)奈米粒子的直徑、形狀稍作變化時(shí)，也會(huì)顯現(xiàn)出不同的顏色。 一般而言，圓形的奈米粒子較易製備，而製造三角形與三稜鏡形奈米

5、粒子雖較困難，但均已找出製備的方法。因此，只要操縱顆粒的大小、形狀與種類即可達(dá)到不同的呈色結(jié)果。 下述三種DNA偵測(cè)技術(shù)中，都是利用金奈米粒子為材料，第一種是利用DNA抓住奈米粒子而呈色；第二種是以金奈米粒子顏色變化的特性為基礎(chǔ)，增加溫度後即可鑑別不同的DNA序列；第三種則是利用DNA促成奈米粒子整齊排列，進(jìn)而形成電流通路，而達(dá)到偵測(cè)DNA的目的。由於這些偵測(cè)技術(shù)的選擇性極高，即使DNA片段中僅有一個(gè)鹼基的差異，亦能分辨得出來(lái)，因此應(yīng)可取代螢光呈色的技術(shù)而應(yīng)用在基因晶片上。 掃描式DNA感應(yīng)器 莫金教授的研究群發(fā)表的掃描式DNA感應(yīng)器，是以金奈米粒子的呈色為基礎(chǔ)。它的原理是以人工合成兩種不同長(zhǎng)

6、度的單股DNA序列，各為12個(gè)與15個(gè)鹼基，將它們分別固定在玻片與直徑約為13奈米的金奈米粒子上，在金奈米粒子上所連接的DNA序列稱為探針序列，另外在載玻片上的DNA序列稱為捕捉序列。這兩種DNA序列可分別與欲測(cè)樣品中具有27個(gè)鹼基長(zhǎng)度的標(biāo)的DNA的兩端互補(bǔ)配對(duì)，形成類似三明治般的構(gòu)造。 如同一般的基因晶片，掃描式DNA 感應(yīng)器是預(yù)先在載玻片上將許多不同的DNA序列a、c、d、e等予以固定。其中只有序列a才能與標(biāo)的DNA序列（ab）的一端形成互補(bǔ)配對(duì)。三者混合後，序列ab分別和玻片上序列a與金奈米粒子上的b形成結(jié)合。再用緩衝溶液將未配對(duì)或多餘的DNA序列清除。若樣品中標(biāo)的DNA序列的濃度夠高，

7、則會(huì)顯出淡淡的粉紅色，再以含有硝酸銀的溶液處理，由於金奈米粒子可促進(jìn)銀的沈積，便可呈現(xiàn)黑色。 利用此種配對(duì)原理，可將金奈米粒子間接地固定在玻片上。當(dāng)其序列間的鹼基能完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，其結(jié)合力最強(qiáng)，若無(wú)法完全配對(duì)時(shí)，結(jié)合力即減弱，因此可藉著增加溫度，而使得非標(biāo)的DNA序列脫離。 在經(jīng)過(guò)增溫處理以確定僅存專一性結(jié)合後，存在的足量金奈米粒子會(huì)使樣品呈現(xiàn)粉紅色（樣品莫耳濃度為10-8、未以銀離子顯影液處理者），但是當(dāng)樣品中的標(biāo)的DNA濃度降低時(shí)，粉紅色即變淡，無(wú)法以肉眼覺(jué)察（樣品莫耳濃度為10-10、未以銀離子顯影液處理者）。 為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員發(fā)現(xiàn)可加入含有銀離子的顯影液。因?yàn)榻鹉蚊琢Ｗ涌纱龠M(jìn)

8、銀離子與顯影液中所含還原劑（氫）之間的反應(yīng)而生成還原態(tài)的銀，銀的沉積會(huì)顯出黑色，不但容易辨識(shí)，而且可用一般傳統(tǒng)的光學(xué)掃描儀器偵測(cè)。利用所得深淺不同的結(jié)果以灰階加以相互比較，就可區(qū)別樣品間濃度的高低，甚至能輕易地以肉眼觀察，因此大大提升了敏感度。即使當(dāng)DNA序列間的差異只有一個(gè)鹼基時(shí)，都能區(qū)分出來(lái)。 由此掃描式DNA感應(yīng)器所檢測(cè)的結(jié)果顯示，在較低溫時(shí)（攝氏40度），除了正確配對(duì)的鹼基A之外，其他三種錯(cuò)誤的G、T、C鹼基對(duì)亦可結(jié)合。但是當(dāng)溫度提升至攝氏50度時(shí)，僅有正確的腺嘌呤（A）仍然維持配對(duì)狀態(tài)，其他三種（亦即G、T、C）的呈色會(huì)消失，因此決定選擇性的溫度是攝氏50度。若是溫度繼續(xù)升高至攝氏6

9、0度，即使是含有正確的腺嘌呤（A）的DNA序列也會(huì)脫離，而導(dǎo)致呈色完全消失。 以螢光為呈色的方法雖也有類似的結(jié)果，但是增溫範(fàn)圍太?。〝z氏15度至35度），決定專一性結(jié)合的溫度也較掃描式DNA感應(yīng)器來(lái)得低。因此，溫度的變化只要高於正確結(jié)合的溫度攝氏35度，就會(huì)導(dǎo)致專一性結(jié)合的DNA序列脫離而使得呈色減弱。此外，由於實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要反覆地以溶液沖洗，當(dāng)正確序列結(jié)合的溫度太接近室溫時(shí)，會(huì)使得部分專一性與非專一性結(jié)合的DNA序列較容易一起被洗掉，因此其呈色普遍性地較為微弱。 由於掃描式DNA感應(yīng)器的專一性結(jié)合溫度較高，就可以避免這種困擾。其敏感度較一般以螢光劑為呈色的方法高100倍，而且對(duì)於單一鹼基錯(cuò)誤

10、配對(duì)的選擇性也高出3倍。同時(shí)，因?yàn)閽呙枋紻NA感應(yīng)器的敏感度較高，對(duì)於樣品的量要求也就較低，因此優(yōu)於一般以螢光呈色的DNA感應(yīng)器。 以掃描式DNA感應(yīng)器來(lái)偵測(cè)樣品中的DNA序列時(shí)，樣品中的標(biāo)的DNA序列的濃度高低雖然可藉由灰階來(lái)推測(cè)，但是其結(jié)果僅能以黑白二色呈現(xiàn)，因此每次能檢測(cè)的種類數(shù)目受到較大的限制。以螢光分子為標(biāo)幟的偵測(cè)法中能有顏色上的變化，較受一般檢驗(yàn)人員的歡迎，而且若能以彩色呈現(xiàn)，就可以容許在檢驗(yàn)樣品中一次含有多種待測(cè)的DNA序列，因此，如何將黑白變?yōu)椴噬妥兂裳芯咳藛T的下一個(gè)目標(biāo)。 彩色DNA感應(yīng)器 簡(jiǎn)單地說(shuō)，彩色DNA感應(yīng)器的基本原理與掃描式DNA 感應(yīng)器類似，但其差別為所用的金奈

11、米粒子有兩種不同的直徑。研究人員研發(fā)出一種特殊的化學(xué)方法，可將與欲探測(cè)的兩種DNA序列互補(bǔ)的片段DNA予以修飾後個(gè)別連接在不同大小的金奈米粒子上，其粒子直徑分別為50與100奈米。其中一種DNA（a）與100奈米的金奈米粒子連結(jié)，另外僅有一個(gè)鹼基差異的相似DNA（b）則與50奈米的金奈米粒子連結(jié)。在玻片上事先固定有單股DNA序列（c,d），當(dāng)此種帶有特殊序列的DNA-金奈米粒子，藉由標(biāo)的DNA（ac,bd）分別與玻片上的單股DNA序列結(jié)合後，再以光照射，50奈米的金奈米粒子呈現(xiàn)綠色，而100奈米的金奈米粒子則呈現(xiàn)橘色。 利用此方法，可偵測(cè)兩種不同的DNA序列。在較低溫度下（攝氏4555度），二

12、者均可與玻片上的DNA配對(duì)而呈色，但是將溫度升高至攝氏60度後，有差異的DNA片段就會(huì)因?yàn)槠渲形ㄒ坏囊粋€(gè)相異的鹼基無(wú)法配對(duì)而結(jié)合力減弱，導(dǎo)致脫離，所顯現(xiàn)的綠色也因而消失。 在檢測(cè)的過(guò)程中，隨著溫度的升高，顏色隨之變化，進(jìn)而綠色消失，以肉眼即可觀察到。由此結(jié)果即可判斷，能夠與直徑為100奈米的金奈米粒子配對(duì)的標(biāo)的DNA與50奈米的金奈米粒子配對(duì)的另一種標(biāo)的DNA含有不同的序列。 這種方法目前雖只能比較兩種樣品，但是未來(lái)仍有改善的空間?？山逯淖兘鹉蚊琢Ｗ又睆降拇笮』蛐螤畹牟町悾a(chǎn)生不同的顏色而增加測(cè)試種類的數(shù)目。由於其專一性極高，不但可應(yīng)用在一般的基因檢驗(yàn)上，亦可用來(lái)偵測(cè)基因的單一核酸多型性（s

13、ingle-nucleotide polymorphism，SNP）差異與基因突變所導(dǎo)致的疾病。所謂單一核酸多型性差異是指某些基因在同種但不同的生物個(gè)體之間，其DNA序列僅只有一個(gè)核酸不同，雖然差異極小，但視其基因的重要性仍會(huì)造成明顯的個(gè)體差異。例如，可能會(huì)對(duì)某些疾病特別有抵抗性或是特別易受感染。 電子式DNA感應(yīng)器 這個(gè)研究團(tuán)隊(duì)又研發(fā)出另一種更靈敏的DNA感應(yīng)器。他們?cè)阱冇幸粚友趸奈嫔?，以光蝕刻法製造出來(lái)一種微小電極，在電極間有一極細(xì)小的溝。在此溝中先固定一特定的DNA序列（a），再將電極浸入一種含有標(biāo)的DNA序列（ab）與帶有另一特定序列（b）的金奈米粒子的溶液中。此標(biāo)的DNA序列的

14、兩端可分別與電極溝中的與金奈米粒子上的DNA序列配對(duì)結(jié)合，因此可將金奈米粒子固定在電極溝之間並形成緊密排列，再以含硝酸銀的顯影液加以處理。 因?yàn)榻鹉蚊琢Ｗ涌纱龠M(jìn)銀的還原反應(yīng)，而使得銀沈積在上面，浸在顯影液中的時(shí)間愈久，所沈積的銀粒就愈多，電子便可在兩極間形成通路而產(chǎn)生傳導(dǎo)，其電極間的電阻即大幅降低。因此測(cè)量電阻即可偵測(cè)出是否有DNA序列的配對(duì)結(jié)合。 由於非標(biāo)的DNA序列與電極間序列無(wú)法完全配對(duì)，二者間的結(jié)合力較弱，因此使用含有特定濃度鹽類（10毫莫耳濃度的鈉離子溶液）的溶液予以浸洗後，即可將電極間錯(cuò)誤配對(duì)的標(biāo)的DNA序列洗去。另外，也可以用上述彩色DNA感應(yīng)器中增加溫度的方法來(lái)去除錯(cuò)誤配對(duì)的D

15、NA序列。所以可視當(dāng)時(shí)偵測(cè)環(huán)境的限制，利用這兩種簡(jiǎn)便的方法（溶液沖洗或改變溫度）中任意一種，來(lái)達(dá)到區(qū)分正確的互補(bǔ)配對(duì)DNA序列的目的。 研究人員並發(fā)現(xiàn)此方法所要求的樣品量可低至5 10-13莫耳濃度，這是一般以螢光分子為標(biāo)幟的DNA偵測(cè)法所要求的樣品量的十分之一，而對(duì)於單一鹼基差異的選擇性更高達(dá)十萬(wàn)倍。 從上述的各種檢驗(yàn)方法中，我們看到科學(xué)家們針對(duì)各種問(wèn)題不斷地加以解決、改進(jìn)，巧妙地結(jié)合不同的科學(xué)領(lǐng)域，創(chuàng)造出更精密、更方便、也更快速的DNA感應(yīng)器。在這些研究中，結(jié)合了有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、材料科學(xué)與生物化學(xué)等多方面的知識(shí)，形成團(tuán)隊(duì)，創(chuàng)造了更出色的研究成果。 這些DNA感應(yīng)器可應(yīng)用在各式生物檢測(cè)中，如細(xì)菌、病毒的感染、基因突變、遺傳篩檢，也可在戰(zhàn)爭(zhēng)中檢驗(yàn)生物戰(zhàn)劑。例如，在這三