觀察細(xì)胞內(nèi)藥物濃度方法的比較

1、    觀察細(xì)胞內(nèi)藥物濃度方法的比較        關(guān)鍵詞多藥耐藥； 藥物濃度； 方法比較中國書資料分類法分類號 腫瘤細(xì)胞對不同抗腫瘤藥物發(fā)生交叉耐藥, 稱為多藥耐藥(multidrug resistance， MDR)。目前，正是由于腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象的普遍存在，使得腫瘤化療難以達(dá)到令人滿意的效果。因此，對多藥耐藥現(xiàn)象的研究成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。目前已發(fā)現(xiàn)與腫瘤耐藥相關(guān)的機(jī)理是：P-糖蛋白的表達(dá);耐藥相關(guān)蛋白（MRP）的表達(dá);拓?fù)洚悩?gòu)酶的減低;谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶的改變;其他

2、，包括蛋白激酶C（PKC）、肺相關(guān)蛋白（LRP）等。其中胞內(nèi)藥物濃度降低是發(fā)現(xiàn)最早并被認(rèn)為是最重要的耐藥機(jī)制。因此，觀察胞內(nèi)藥物濃度的變化也成為觀察耐藥細(xì)胞、耐要機(jī)制和化療預(yù)后的一個(gè)重要方法。本文作者在對腫瘤耐藥進(jìn)行多年研究中，曾運(yùn)用一系列方法對細(xì)胞內(nèi)藥物濃度進(jìn)行觀察，現(xiàn)將幾種較為成熟的方法對比如下。1材料與方法11細(xì)胞及試劑胃癌細(xì)胞SGC7901由軍科院惠贈(zèng)。胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR由我所蔡學(xué)君博士初步誘導(dǎo)。阿霉素購自Farmitalia Carlo Erba。 RPMI 1640購自Gibco。小牛血清購自浙江金華。3H-阿霉素購自New England Nuclear。 流式

3、細(xì)胞分析儀，熒光倒置顯微鏡，熒光分光光度計(jì)，高速臺(tái)式離心機(jī)，液體閃爍記數(shù)儀。12方法121流式細(xì)胞儀法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度1。在對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR08的培養(yǎng)皿中加入阿霉素，使其在培養(yǎng)液中的濃度達(dá)到5 g/ml，在37，5%CO2的溫箱中溫育不同的時(shí)間段，隨后收取細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，重懸于冷PBS 中，40下保存至上樣行流式細(xì)胞儀檢測。檢測激發(fā)波長為488 nm，接受波長為575 nm。122熒光分光光度計(jì)法FACS（貼壁細(xì)胞）SGC7901和SGC7901/VCR08消化、吹打下來后，離心,再懸浮呈1×105/ml的細(xì)胞懸液,在12孔板各加入1

4、ml細(xì)胞懸液, 每孔約1×105個(gè)細(xì)胞，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置37，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)過夜。24 h后，待細(xì)胞貼壁后，依次加入阿霉素（ADM）至終濃度為5 g/ml，10 g/ml，15 g/ml，20 g/ml，37， 5%CO2 孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。棄去上清， 生理鹽水洗滌3次，離心，計(jì)數(shù)后加預(yù)冷0.3 NHCl50%乙醇(11)1 ml重懸, 置-20過夜。離心取上清,用熒光分光光度計(jì)測EX495 nm 和EX590 nm,同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線2。123熒光倒置顯微鏡觀察利用熒光倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的變化。取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞，分別加入阿

5、霉素至其終濃度為5 g/ml，5%CO2，37條件下溫育1 h，棄去含藥培養(yǎng)液，加入無藥培養(yǎng)液，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的聚集3。1243H-TdR法收取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，24 h后，待細(xì)胞貼壁后，在無血清培養(yǎng)液中加入3.7 Ci/mmol的3H-阿霉素至其終濃度為5 g/ml，5%CO2，37條件下溫育1 h，使其到達(dá)穩(wěn)定期，離心棄去含藥培養(yǎng)液，用冷PBS將細(xì)胞洗3次。將細(xì)胞在0.2 ml含0.5%SDS 的PBS中重懸,裂解，用液閃儀測定其放射性4。2結(jié)果與討論

6、用不同濃度的阿霉素與上述2種細(xì)胞共溫育不同時(shí)間后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的變化。從實(shí)驗(yàn)中可見藥物進(jìn)入胞內(nèi)后，在3 h時(shí)耐藥細(xì)胞與藥敏細(xì)胞均出現(xiàn)一個(gè)高峰，但以藥敏細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度高且細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度蓄積較快，隨后在39 h之間胞內(nèi)藥物濃度開始降低，又以耐藥細(xì)胞中的藥物濃度降低較快為特征。在924 h之間2種細(xì)胞的胞內(nèi)藥物濃度均開始上升。用熒光分光光度計(jì)測得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，觀察阿霉素從藥敏細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中泵出的試驗(yàn)顯示，細(xì)胞對阿霉素產(chǎn)生抗性后，在培養(yǎng)相同的時(shí)間后，阿霉素在耐藥細(xì)胞內(nèi)濃度降低速度較藥敏細(xì)胞明顯加快，尤以前10 min內(nèi)降低最明顯（2檢驗(yàn)，P<0.05）。用熒光倒置顯微鏡

7、觀察細(xì)胞，可直觀地發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞中藥物濃度明顯低于藥敏細(xì)胞。 在激發(fā)光的激發(fā)下，可發(fā)現(xiàn)藥敏細(xì)胞的胞膜和部分胞漿中發(fā)出橙黃色較強(qiáng)的熒光， 形成對比的是在染色同樣長時(shí)間的情況下耐藥細(xì)胞中的熒光非常淡， 只可勉強(qiáng)辨認(rèn)細(xì)胞的輪廓。用放射性同位素測得的細(xì)胞內(nèi)濃度，結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞與藥敏細(xì)胞中藥物儲(chǔ)留有較大差距，尤其在用藥溫浴10 min后，差異越來越明顯（2檢驗(yàn)，P<0.05）。耐藥細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度呈快速下降趨勢， 而藥敏細(xì)胞中的藥物濃度呈緩慢下降趨勢。 在50 min內(nèi)耐藥細(xì)胞的藥物濃度為最初的1/3，而藥敏細(xì)胞中的藥物濃度仍保持在80%左右。1976年，Juliano發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞膜表面蛋白發(fā)生

8、變化，過度表達(dá)一種分子量為170 kD的糖蛋白，這種糖蛋白被稱為P-gp，并認(rèn)為它與胞內(nèi)藥物濃度的降低有關(guān)。研究表明，P-gp的主要作用是將胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表面廣泛表達(dá)的P-gp，由此導(dǎo)致的胞內(nèi)藥物濃度變化是影響腫瘤化療效果的主要原因。因而研究胞內(nèi)藥物濃度的改變?nèi)允且环N觀察腫瘤細(xì)胞耐藥性及藥物在細(xì)胞內(nèi)分布的主要指標(biāo)。阿霉素具有自發(fā)熒光，而且是P-糖蛋白的底物，利用各種方法檢測胞內(nèi)的熒光,從而作為藥物濃度的一個(gè)指標(biāo)。另外，也可利用羅決明作為指示劑，羅決明是一種熒光物質(zhì)，同時(shí)也是P-糖蛋白的底物。在腫瘤的耐藥中，多為多藥耐藥，其對阿霉素、長春新堿、5-氟尿嘧啶等一系列結(jié)構(gòu)不相同的

9、藥物同時(shí)出現(xiàn)耐藥，因而用阿霉素作為指示劑具有一定的普遍性。在本試驗(yàn)中，作者利用3種方法來檢測阿霉素的熒光，它們之間的結(jié)果可以互相印證，從而使試驗(yàn)者更加確信試驗(yàn)的結(jié)果。流式細(xì)胞儀方法簡單，可長期、重復(fù)觀察同一樣本或不同時(shí)間段的樣本，其結(jié)果穩(wěn)定，與其他方法所得結(jié)果的吻合性好；同時(shí)也是一種定量研究,在臨床上有可能實(shí)現(xiàn),且比較PCR和免疫組化來檢驗(yàn)P-gp的基因或蛋白表達(dá)省時(shí)、快捷，可重復(fù)。熒光倒置顯微鏡檢測屬于一種定性試驗(yàn)，直觀、可信，與其他的試驗(yàn)結(jié)果是一個(gè)很好的印證。雖然，熒光倒置顯微鏡價(jià)格昂貴、標(biāo)本取材復(fù)雜不適于臨床應(yīng)用，但在實(shí)驗(yàn)研究上不失為一種重要的定性方法。熒光分光光度計(jì)檢測其方法比較繁瑣，

10、其主要目的是檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，在檢測之前需要清洗細(xì)胞、裂解細(xì)胞，影響因素較多，例如光化分解、熒光淬滅、pH的影響等。雖然這是一個(gè)定量試驗(yàn)，但試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較差，受試驗(yàn)條件的限制，但仍不失為一種可行的方法。用同位素標(biāo)記藥物來檢測，定量準(zhǔn)確，試驗(yàn)結(jié)果可靠，重復(fù)性好，操作簡單，但是由于我國尚不能標(biāo)記這一類同位素，所有藥品都需進(jìn)口，費(fèi)用較高，對人體有一定的傷害,試驗(yàn)應(yīng)在專用放射性實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按有關(guān)放射性操作規(guī)程進(jìn)行。總之，以上的幾種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，試驗(yàn)者可根據(jù)試驗(yàn)條件和經(jīng)費(fèi)情況選擇使用。本課題受國家自然科學(xué)基金(39770665)資助王少東（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病研究所西安710032）張杏泉（

11、第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科研究所 西安 710038）樊代明（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病研究所西安710032）參 考 文 獻(xiàn)1，Guerci A, Louis J, Missoum J. Predictive value for treatment outcome in acute myeloid leukemia of cellular daunorubicin accumulation and P-glycoprotein expression simultaneously determined by flow cytometry. Blood, 1995, 85(8): 21472，Ta

12、keda Y, Nishio K, Niitani H. Reversal of multidrug resistance by tyrosine-kinase inhibitors in a non-P-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line. Int J Cancer, 1994, 57: 2293，Sognier MA, Zhang Y, Eberle RL. Sequestration of doxorubicin in vesicles in a multidrug-resistant cell line (LZ-100). Biochem Pharmacol， 1994, 48(2): 3914，