供者使用粒系集落刺激因子后供髓對(duì)異基因骨髓移植受者的影響

1、    供者使用粒系集落刺激因子后供髓對(duì)異基因骨髓移植受者的影響        【摘要】目的觀察供者使用粒系集落刺激因子(G-CSF)后供髓對(duì)異基因骨髓移植受者造血重建及移植物抗宿主病（GVHD）發(fā)生的影響。方法用HLA相合,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）陰性的供者骨髓,給受者行異基因骨髓移植，在預(yù)處理方案、GVHD的預(yù)防及支持治療方法相同的條件下，比較研究組30例供者應(yīng)用G-CSF 34g.kg-1.d-1，連用7d后采髓和對(duì)照組15例供者常規(guī)采髓對(duì)受者異基因骨髓移植造血重建和

2、GVHD發(fā)生的作用。結(jié)果在類同采髓量中研究組所獲單核細(xì)胞(MNC)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落生成單位(CFU-GM)及CD34數(shù)顯著大于對(duì)照組（P<0.01)。研究組受者移植后中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)>0.5×109/L與血小板>20×109/L時(shí)間分別為（16.7±3.2）d與(18.4±3.0)d,對(duì)照組為(22.5±5.1)d與(26.3±5.90)d,P<0.01，研究組造血重建加速。研究組受者急性-度 GVHD發(fā)生1例（發(fā)生率3.3%），對(duì)照組發(fā)生率26.7%（P<0.05）。慢性GVHD兩組差異無(wú)顯著性(P&

3、gt;0.05)。輸入的T淋巴細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯改變，通過(guò)比較，研究組受者CD4減少，CD8增加（P<0.01)。結(jié)論HLA相合的異基因骨髓移植，使用經(jīng)G-CSF動(dòng)員的供者骨髓，可使受者造血重建加快，尤其減輕重度急性GVHD，這一作用可能與骨髓內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群變化有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】異基因骨髓移植；粒系集落刺激因子；造血重建；移植物抗宿主病 Effect of donor marrow stimulated with lenograstim on hemotopoietic reconsititution and GVHD incidence in the patients with Allo-

4、BMTJI Shuquan,CHEN Huiren,WANG Hengxiang，et al.(Reseach Center for Hematology,The General Hospital of Air Force PLA,Beijing 100036,China)【Abstract】ObjectivesIn order to investigate the influence of donor marrow stimulated with lenograstim (G-CSF) on hemotopoietic reconstitution and incidence of GVHD

5、 in the patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation (Allo-BMT).MethodsForty-five leukemia patients as recipients underwent Allo-BMT with the bone marrow from the donors with matching HLA and negative mixed lymphocyte culture reaction.The 30 donors (experimental group) were given G-CSF

6、 3-4g.kg-1.day-1 for 7 days prior to marrow harvest.And 15 donors as control group did not receive G-CSF.The effects of G-CSF on hemotopoietic reconstitution and incidence of GVHD following Allo-BMT were compared between the two groups.ResultsIn the equal volume of bone marrow harvested,the number o

7、f mononuclear cells,CFU-GM and CD34 cells in the experimental group were higher than in the control group (P<0.01).In the experimental group,the time of granulocyte count exceeding 0.5×109/L and plalete count exceeding 20×109/L was (16.7±3.2)days and (18.4±3.0)days respectivel

8、y,significantly shorter than in the control group (22.5±5.1)days and (26.3±5.9)days,respectively) (P<0.01).The incidence of grade - aGVHD were 3.3% in the experimental group,significantly lower than in control group (26.7%,P<0.05).There was no obvious change in the total number of in

9、fused T lymphocyte subsets.In the experimental group CD4 was decreased and CD8 increased markedly as compared with control group (P<0.01).ConclusionsThe donor bone marrow stimulated with G-CSF could significantly accelerate the hemotopoietic reconstitution,especially alleviate aGVHD during Allo-B

10、MT,which might be related with the change in T lymphocytic subpopulation in bone marrow.【Key words】Allo-BMT；Lenograstim；Hemotopoietic reconstitution；GVHD異基因外周血干細(xì)胞移植，具有造血重建快，粒細(xì)胞缺乏和血小板減少期縮短，增加了移植期的安全性，由于輸入T淋巴細(xì)胞數(shù)量較多，可能增加GVHD的發(fā)病率，特別是慢性GVHD1。在小鼠不相合的骨髓移植實(shí)驗(yàn)研究中，使用經(jīng)G-CSF動(dòng)員的供者骨髓，移植后降低了重癥GVHD的發(fā)生，提高了生存率2；促進(jìn)了異基因

11、干細(xì)胞移植造血重建的速度，減少了嚴(yán)重的GVHD的發(fā)生。本院在HLA相合的異基因骨髓移植中，使用經(jīng)G-CSF動(dòng)員的供者骨髓，取得良好的療效，報(bào)道如下。臨 床 資 料于1997年1月至1999年1月連續(xù)對(duì)45例HLA相同，MLC陰性的同胞兄妹的白血病患者，進(jìn)行了異基因骨髓移植，研究組30例中，平均年齡35.5歲；男19例，女11例。其中慢性粒細(xì)胞白血病15例（10例在慢性期，5例加速期），急性粒細(xì)胞白血病8例（CR1 7例，CR21例），急性淋巴細(xì)胞白血病7例（CR1 5例，CR2 2例）。對(duì)照組15例中，平均年齡33.2歲；男9例，女6例。其中慢性粒細(xì)胞白血病 7例（5例在慢性期，2例加速期），

12、急性粒細(xì)胞白血病5例（CR1 4例，CR2 1例），急性淋巴細(xì)胞白血病3例（CR1 2例，CR2 1例）?；颊唠m然為非隨機(jī)選擇，但全部病例在同一時(shí)期進(jìn)行移植。研究組選用的供者均提前使用G-CSF,而對(duì)照組供者未接受G-CSF。受者均使用常規(guī)預(yù)處理方案；在研究組中，13例使用環(huán)磷酰胺60 mg.kg-1.d-1×2 d，全身照射8 Gy分兩次（-3，-2 d）給予；6例粒細(xì)胞白血病在以上基礎(chǔ)上加用馬利蘭， 總劑量34 mg/kg，在-6和-5 d給藥；1例急性淋巴細(xì)胞白血病在環(huán)磷酰胺與全身照射前-6和-5 d給阿糖胞苷2.0g.(m2)-1.d-1；10例患者用馬利蘭4 mg.kg-1

13、.d-1， 連用4 d后，用環(huán)磷酰胺60 mg.kg-1.d-1×2 d。對(duì)照組中，7例用環(huán)磷酰胺和全身照射；3例加用馬利蘭后用環(huán)磷酰胺和全身照射；5例用馬利蘭和環(huán)磷酰胺。骨髓輸注時(shí)為0 d。研究組的供者用G-CSF 34 g.kg-1.d-1皮下注射，連用7 d，第8 d于硬外膜麻醉下髂后采髓，平均采髓1.10 L（范圍0.61.5);對(duì)照組采髓1.15 L(范圍0.61.6)。單個(gè)核細(xì)胞用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD34及T淋巴細(xì)胞亞群CD3,CD4和CD8，在0 d回輸新鮮未去T骨髓，ABO主要血型不合用羥乙基淀粉沉降去除紅細(xì)胞。兩組受者支持治療相同，全部病例均入住

14、層流室，雙蒸飲食，口服磺胺甲噌惡唑（SMZ）與氟康唑作為抗細(xì)菌和抗霉菌預(yù)防性用藥，無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷作為預(yù)防性抗病毒藥，移植后第1 d給丙種球蛋白，每周劑量為500 mg/kg，移植后第1 d起給G-CSF,劑量是34 g.kg-1.d-1,皮下注射，直到中性粒細(xì)胞達(dá)到0.5×109/L，并穩(wěn)定3 d后停藥。如移植后血色素降低到80 g/L、血小板低于20×109/L或有出血傾向時(shí)，輸注照射后的紅細(xì)胞或血小板。急性GVHD預(yù)防的方法是環(huán)孢素A聯(lián)合短程氨甲碟呤，氨甲碟呤劑量是7.5mg/m2,于移植后第1、3、6、11 d靜脈給藥，環(huán)孢素A 2.5 mg.kg-1.d-1,從-1 d始

15、，至腸道功能正常時(shí)改口服，劑量5 mg.kg-1.d-1，分3次給藥，在移植后第50 d，環(huán)孢素A以每周5%劑量減量，如無(wú)慢性GVHD發(fā)生，于移植后6個(gè)月停藥，環(huán)孢素A使用期間，采用熒光偏振免疫測(cè)定方法，每周監(jiān)測(cè)環(huán)孢素A的血濃度，當(dāng)環(huán)孢素A高于300 g/L或血清肌酐超過(guò)176.8 mol/L時(shí)，適當(dāng)減量。發(fā)生急性GVHD高于度時(shí)，加用甲潑尼龍12 mg.kg-1.d-1。植入的確定，每天計(jì)數(shù)血細(xì)胞，中性粒細(xì)胞大于0.5×109/L及血小板大于50×109/L，為植入成功，移植后1個(gè)月，進(jìn)行骨髓涂片與骨髓活檢及染色體檢查，取得移植證據(jù)，如臨床需要?jiǎng)t作進(jìn)一步檢查。流式細(xì)胞及祖

16、細(xì)胞測(cè)定：應(yīng)用雙標(biāo)或3標(biāo)直接染色方法，加抗CD34,CD3,CD4和CD8（庫(kù)爾特試劑)單克隆抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CFU-GM用半固體瓊脂培養(yǎng)法測(cè)定。結(jié)果1.移植物特點(diǎn)： 研究組和對(duì)照組移植物成分見(jiàn)表1，在研究組中，單個(gè)核細(xì)胞、CD34與CFU-GM數(shù)量均高于對(duì)照組（P<0.01)；兩組CD3數(shù)量類同（P>0.05),而CD4降低，CD8增加顯著（P<0.01)。植入物成分研究組(n=30)對(duì)照組(n=15)P值MNC(×108/kg)6.9±2.12.7±1.5<0.001CD34(×106/kg)7.6±2.52.

17、3±0.8<0.001CFU-GM(×104/kg)82±2517±6<0.001CD3(×106/kg)33.2±5.131.8±4.70.05CD4(×106/kg)13.0±2.916.8±3.2<0.01CD8(×106/kg)16.5±3.311.3±2.0<0.01     2.造血植入： 全部病例均取得骨髓三系移植成功，移植結(jié)果顯示，研究組中性粒細(xì)胞與血小板植入迅速，中性粒細(xì)胞>0.

18、5×109/L的時(shí)間是(16.7±3.2)d,血小板大于20×109/L的時(shí)間是(18.4±3.0) d,而對(duì)照組分別是(22.5±5.1)d和(26.3±5.9)d ,提示供者應(yīng)用G-CSF能夠促粒細(xì)胞和血小板恢復(fù)時(shí)間加速(P<0.01)。3.移植物抗宿主病(GVHD)： 研究組30例患者中,急性度GVHD發(fā)生率是36.7%,對(duì)照組急性度GVHD發(fā)生率40%,通過(guò)比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。研究組中重度GVHD發(fā)生低，發(fā)生率是3.3%，僅1例患者發(fā)生局限于皮膚度GVHD，短程激素治療迅速控制。對(duì)照組度以上GVHD

19、發(fā)生率是26.7%，兩組比較， P<0.05。在研究組中，可評(píng)價(jià)的23例患者中6例發(fā)生慢性GVHD,對(duì)照組可評(píng)價(jià)的10例中4例發(fā)生慢性GVHD。發(fā)生率分別是26.1%和40%，兩組之間差異不顯著（P>0.05)。4.隨訪結(jié)果： 研究組平均隨訪696 d（范圍在3701065 d），對(duì)照組平均隨訪712 d（范圍在3821090 d）,移植相關(guān)死亡分別為2例（6.7%)與3例(20%),移植后復(fù)發(fā)病例分別為5例(16.6%)與2例(13%),兩組復(fù)發(fā)率差異無(wú)顯著性（P>0.05)。研究組和對(duì)照組死亡病例的原因和例數(shù)分別為：（1）GVHD致死為0與2例；（2）重度肝炎死亡1與0例

20、；（3）感染為1與1例；（4）白血病復(fù)發(fā)為5和2例。目前研究組30例中23例存活，對(duì)照組15例中10例仍存活,3年無(wú)病存活率分別為76.6%與66.7%,研究組有改善無(wú)病存活率傾向。 討論供者使用G-CSF后采集的骨髓，含有較高的CD34細(xì)胞，通過(guò)干細(xì)胞的培養(yǎng)研究了解到CFU-GM與早期植入相關(guān)，而長(zhǎng)期培養(yǎng)的起始細(xì)胞（LTC-IC)與晚期植入相關(guān)，LTC-IC加入細(xì)胞周期需要骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持與細(xì)胞因子調(diào)控3。而提前動(dòng)員供者骨髓，除獲得大量CFU-GM外,又具備使LTC-IC進(jìn)入細(xì)胞周期的必備條件，可能是促進(jìn)造血的基礎(chǔ)。 本研究組所有患者隨訪1年以上，均證明完全供者造血重建,未觀察到早期或晚期移

21、植失敗,說(shuō)明供者用低劑量G-CSF（34 g.kg-1.d?-1）,連用7 d后采集骨髓,可獲得較高的單核細(xì)胞和CFU-GM。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組和對(duì)照組在輸入淋巴細(xì)胞和CD3細(xì)胞數(shù)量類同,GVHD預(yù)防方案一致的條件下,研究組度以上急性GVHD發(fā)生率與對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)。本結(jié)果與Atkinson等4與Isola等5報(bào)告的結(jié)果十分吻合。許多報(bào)告強(qiáng)調(diào)細(xì)胞因子在急性GVHD中的調(diào)節(jié)作用7，在外周血干細(xì)胞移植中，自正常供者單采的T淋巴細(xì)胞高于正常骨髓采集T淋巴細(xì)胞數(shù)量的10倍以上，并增加外周血的淋巴細(xì)胞，但CD4與CD8無(wú)比值上的變化8。本組研究中,供者使用G-CSF的骨髓中CD

22、3百分比未增加，但CD4/CD8發(fā)生有意義的降低，CD4與CD8通過(guò)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)換成兩種不同特點(diǎn)的淋巴細(xì)胞9，正常志愿者接受G-CSF，可影響單核細(xì)胞對(duì)脂多糖類的需求，通過(guò)上調(diào)兩種重要的細(xì)胞因子的拮抗劑溶解腫瘤壞死因子與介素受體，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中均顯示降低重癥GVHD。用G-CSF細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的T細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞可能幫助說(shuō)明經(jīng)G-CSF動(dòng)員的外周血干細(xì)胞移植， 臨床上GVHD發(fā)生率不與輸入T淋巴細(xì)胞成比例， 證明GVHD發(fā)生率低是多因素的，并非一種細(xì)胞因子的增加或減少。作者單位：紀(jì)樹(shù)荃(解放軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)陳惠仁(解放軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)王恒湘(解放

23、軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)朱玲(解放軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)薛梅(解放軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)劉靜(解放軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)琚新生(解放軍空軍總醫(yī)院血液科北京，100036)參考文獻(xiàn)1，Korbing M,Hun YO,Durett A,et al.Allogeneic blood stem cell transplantation:peripheralization and yield of donor-derived primitive hematopoietic progenitor cell (CD34+Thy-Idim)and

24、 lymphoid subsets,and possible predictors of engraftment and graft-versus-host disease.Blood,1995,86:2842.2，Pan L,Demonte J,Jalonen CK,et al.Pretreatment of donor mice with granulocyte colony-stimulating factor polarizes donor T lymphocytes toward type-2 cytokine production and reduces severity of e

25、xperimental graft-versus-host disease.Blood,1995,86:4422-4429.3，Sutherland H,Eaves CJ,Lansdorp PM,et al.Differential regulation of primitive human hematopoietic cell in long-term cultures maintained on genetially engineered murine stromal cell.Blood,1991,78:666-672.4，Atkinson K,Fay K,Smith IN,et al.Lenograstim administration to HLA-identical donor-recipient pairs to accelerate marrow recovery post-transplant.Bone Marrow Transplant,1997,19:15-21.5，Isola LM,Scigliano E,Skerrett D,et al.A pilot study of allogeneic