毛細(xì)管電泳法測定青葉膽中獐牙菜苦苷和異牡荊素的含量

1、2040藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(12)3毛細(xì)管電泳法測定青葉膽中獐牙菜苦苷和異牡荊素的含量肖琳,李靜,孫文基33(西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實驗室,西安710069)摘要目的:建立測定青葉膽中獐牙菜苦苷和異牡荊素含量的高效毛細(xì)管電泳分析方法。方法:青葉膽藥材粉末經(jīng)50%甲醇溶液超聲提取后,采用未涂層彈性石英毛細(xì)管柱(6012cm75m,有效長度50cm)作為分離通道;以含5%甲醇的50mmolL-l硼砂(pH=9137)為運(yùn)行緩沖溶液;分離電壓15kV;檢測波長236nm;柱溫25。結(jié)果:獐牙菜苦苷和異牡荊素濃度分別在01130411304mgmL-l(r=01

2、9998)和01029801298mgmL-l(r=019994)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;平均回收率(n=6)分別為9815%和9913%,RSD均小于2%。結(jié)論:本法簡便、快速,可用于青葉膽中獐牙菜苦苷和異牡荊素的含量測定。關(guān)鍵詞:青葉膽;獐牙菜苦苷;異牡荊素;毛細(xì)管電泳;含量測定中圖分類號:R917文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0254-1793(2009)12-2040-04HPCEdeterminationofnin3SwertiamL.ShihXin,IJing,SUNWen-ji33(BKeyLaboratoryofShaanxiProvince,NorthwestUniversity,

3、Xian710069,China)AbstractObjective:TodevelopanHPCEmethodfordeterminationofswertiamarinandisovitexininSwertiamileensisT.N.HoetW.L.Shih.Methods:SwertiamarinandisovitexininSwertiamileensiswereextractedwith50%methanolsolutionbysupersonicwavetechnique,andthendeterminedbycapillaryelectrophoresis.Auncoated

4、fused-silicacapillarycolumn(6012cm75m,aneffectivelengthof50cm)wasadopted.Therunningbufferwascomposedof50mmolL-lboraxsolutioncontaining5%methanol(pH=9137).Theappliedvoltagewas15kVandthecapillarytemperaturewas25.Thedetectionwavelengthwas236nm.Results:Agoodlinearitybe2-ltweenpeakareaandconcentrationwas

5、foundintherangeof011304-11304mgmL(r=019998)forswer2-ltiamarinand010298-01298mgmL(r=019994)forisovitexin;Theiraveragerecoveries(n=6)were9815%and9913%respectively,andtherelativestandarddeviationwaslessthan210%.Conclusion:Themethodissimpleandrapid.ItcanbeusedtodetermineswertiamarinandisovitexininSwerti

6、amileensis.Keywords:Swertiamileensis;swertiamarin;isovitexin;capillaryelectrophoresis(CE);contentdetermination青葉膽別名彌勒獐牙菜、金魚膽、走膽藥,為龍膽科獐牙菜屬植物青葉膽SwertiamileensisT.N.HoetW.L.Shih的干燥全草。主要分布于云南、四川、貴州、廣東、廣西、湖南、福建等地。全草入藥,具有清肝利膽、清熱利濕的功效,用于黃疸尿赤、熱淋2澀痛等癥。青葉膽化學(xué)成分眾多,主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、酮類、三萜類以及微量的內(nèi)酯類化合3物。獐牙菜苦苷為環(huán)烯醚萜苷類化

7、合物,是青葉3西北大學(xué)研究生自主創(chuàng)新資助項目(項目編號08YZZ36)33通訊作者Tel:(029)88304569;E-mail:cxbml1膽的主要化學(xué)成分之一,具有保肝、解痙、鎮(zhèn)痛和抗4炎等作用;異牡荊素為青葉膽中的黃酮類成分,5,6具有抗氧化、抗炎等活性。關(guān)于青葉膽中有效7成分的含量測定,文獻(xiàn)報道了紫外分光光度法以及高效液相色譜法對其中的獐牙菜苦苷和齊墩果酸等成分進(jìn)行分析。為探索新的測定方法,本文采用毛細(xì)管電泳方法測定青葉膽中功效成分獐牙菜苦苷和異牡荊素的含量,該法具有操作簡便、快速、9進(jìn)樣量少、成本低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。8藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(12)204

8、11儀器與試藥BeckmanMDQ型毛細(xì)管電泳儀(Beckman儀器公司,美國),配有二極管陣列檢測器(DAD)及32Karat色譜工作站,未涂層石英毛細(xì)管(6012cm75m,有效長度50cm),PHS-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠)。獐牙菜苦苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供,批號為785-9001;異牡荊素對照品由陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實驗室提供,經(jīng)IR、UV、HNMR、13CNMR確證結(jié)構(gòu),峰面積歸一化法計算純度大于98%。青葉膽藥材購自安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司,經(jīng)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王亞洲教授鑒定為青葉膽(SwertiamileensisT.N.HoetW.L.Shih)。曬干

9、后切斷粉碎,過3號篩,備用。所用甲醇為色譜純(限公司),水為重蒸水(自制);硼2B4710H2O)為分析純();化鈉為HPCE級()2溶液的制備211對照品溶液精密稱取對照品獐牙菜苦苷與11(A)的電泳分離圖1sofreferencestandards(A)andsampleprovince(B)(swertiamarin)2.異牡荊素(isovitexin)4線性關(guān)系的考察精密吸取“211”項下的對照品溶液012,014,018,112,116,210mL分別置2mL量瓶中,用50%甲醇定容,即得系列濃度溶液,用上述電泳條件對各濃度溶液進(jìn)行測定。以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo),-l對照品濃度C(m

10、gmL)為橫坐標(biāo),進(jìn)行回歸分析,得獐牙菜苦苷、異牡荊素線性回歸方程分別為:A=56315C+1161210r=019998A=2127010C+2130610r=019994344異牡荊素適量,加50%甲醇溶液制成每1mL含獐牙菜苦苷11304mg、含異牡荊素01298mg的混合溶液,即得。212供試品溶液精密稱取青葉膽藥材粉末1g,置于具塞三角瓶內(nèi),加入50%甲醇溶液20mL,稱定重量,超聲提取(500W,40kHz)015h,放置至室溫,稱重,補(bǔ)足重量。精密移取上清液8mL,蒸干,用50%甲醇溶液溶解,置2mL量瓶中定容后搖勻,0145m濾膜濾過,濾液作為供試品溶液。3毛細(xì)管電泳條件線性范

11、圍分別為01130411304mgmL和01029801298mgmL。5精密度試驗-l-l取“211”項下的對照品溶液,在上述電泳條件下連續(xù)測定6次,獐牙菜苦苷與異牡荊素峰面積的RSD(n=6)分別為0173%和116%。6穩(wěn)定性試驗運(yùn)行緩沖液:含5%甲醇的50mmolL硼砂溶液(pH=9137);壓力進(jìn)樣:31448kPa5s;分離電壓:15kV;毛細(xì)管柱溫:25;檢測波長:236nm;-1毛細(xì)管第1次使用前依次用110molL氫氧化鈉溶液沖洗10min,011molL氫氧化鈉溶液沖洗10min,蒸餾水沖洗3min,運(yùn)行緩沖液沖洗10min;兩次運(yùn)行之間毛細(xì)管依次用蒸餾水沖洗2min,01

12、1-1molL氫氧化鈉溶液沖洗3min,蒸餾水沖洗2min,運(yùn)行緩沖液平衡3min。為了保證重現(xiàn)性,進(jìn)樣5次后,更換同樣濃度的新鮮運(yùn)行緩沖液。-1-l精密稱取過3號篩青葉膽藥材粉末1g,按照“212”項所述方法制備供試品溶液,分別于0,3,5,7,9,12h進(jìn)行測定,獐牙菜苦苷與異牡荊素峰面積的RSD(n=6)分別為0195%和111%。結(jié)果表明,供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。7重復(fù)性試驗精密稱取過3號篩青葉膽藥材粉末6份,每份約1g,按“212”項下方法制備供試品溶液,按“3”項下電泳條件進(jìn)行測定,計算,獐牙菜苦苷與異牡荊素平均含量(n=6)分別為0152%和01068%,RSD分別為115%和

13、114%。在上述電泳條件下得到對照品和樣品電泳分離圖,見圖1。2042藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(12)8回收率試驗1013緩沖液pH對分離的影響緩沖液的pH影精密稱取已知含量的青葉膽藥材粉末015g共6份,每份加入獐牙菜苦苷310mg、異牡荊素01425mg,按“212”項下方法進(jìn)行樣品處理,按“3”項下所響電滲流的大小和被分離溶質(zhì)的電荷,從而影響遷移速率,是毛細(xì)管電泳的重要影響因素。將50mmolL硼砂緩沖液用1molL氫氧化鈉溶液-l-l述電泳條件進(jìn)行測定,測得獐牙菜苦苷與異牡荊素回收率(n=6)分別為9815%和9913%;RSD分別為115%和118%。9

14、樣品測定在pH9101013范圍內(nèi)調(diào)節(jié)pH,結(jié)果表明,pH對分離度的改善不甚明顯。故采用未調(diào)節(jié)時pH為9137的緩沖液作為電解質(zhì)條件。1014有機(jī)溶劑對分離的影響緩沖液中加入有機(jī)試劑可使溶液的電導(dǎo)減小,電流降低,進(jìn)而影響電滲流和分離度。本實驗比較了甲醇、乙腈等有機(jī)試劑,最終選用甲醇,并考察了體積分?jǐn)?shù)分別為5%,10%,15%,20%。結(jié)果表明,而甲醇體,分離效果較為5%。15提高運(yùn)行電壓,可,提高分離效率,但電壓增高的同時也會導(dǎo)致焦耳熱增加,進(jìn)而造成分離效率的下降。分別考察10,15,20,25kV電壓條件下獐牙菜苦苷和異牡荊素的分離效果,兩者遷移時間差隨電壓增大而減小,考慮到青葉膽藥材中其他

15、成分干擾的影響,故15kV的電壓較為合適。1016檢測波長的選擇本實驗采用紫外可見分光光度儀對獐牙菜苦苷和異牡荊素的甲醇溶液掃描,獐牙菜苦苷的最大吸收波長為236nm,異牡荊素的最大吸收波長為214nm、272nm和332nm?？紤]到同時測定二者,用二極管陣列檢測器,試用了210nm、220nm、228nm、236nm、245nm、254nm、270nm、330nm等一系列波長檢測,認(rèn)為236nm較為合將所得10批青葉膽藥材粉末按“212”項下方法制備成供試品溶液,并按上述電泳條件進(jìn)行分析,每份溶液進(jìn)樣3次。以外標(biāo)兩點(diǎn)法計算含量,測定結(jié)果見表1。表1青葉膽樣品測定結(jié)果(n=3)Tab1Thed

16、eterminationresultofswertiamarinandisovitexin獐牙菜苦苷(swertiamarin)來源(source)異牡荊素(isovitexin)含量(/%01010750108501083010770105901084010980110001092RSD0189210118117214218215117210210含量(content)/%01580101600157015701510155018901930161RSD/%12131172150173117216213114116湖南(Hunan)安徽(Anhui)福建(Fujian)廣東(Guangdon

17、g)廣西(Guangxi)貴州(Guizhou)山東(Shandong)四川(Sichuan)云南(Yunnan)浙江(Zhejiang)10討論1011樣品提取方法的考察樣品提取時常采用的方法有回流提取法、超聲提取法,對于這2種方法對中藥材成分是否產(chǎn)生影響,尚未見文獻(xiàn)報道,但超聲提取法方法簡單,所需時間較短,且易于操作,故采用超聲提取法。此外,本實驗依次考察了不同濃度的甲醇分別超聲提取10,20,30,40,60,90min對獐牙菜苦苷與異牡荊素含量的影響。結(jié)果表明采用50%甲醇較其他溶劑效率更高,且提取30min時2適,既適用于測定獐牙菜苦苷,也適用于測定異牡荊素。1017小結(jié)本實驗通過對

18、不同電泳條件和電解質(zhì)體系的優(yōu)化及系統(tǒng)方法學(xué)的研究,建立了高效毛細(xì)管電泳測定青葉膽中獐牙菜苦苷與異牡荊素含量的方法,該方法靈敏度高,快速,重復(fù)性、穩(wěn)定性好,環(huán)境友好;相對于HPLC,具有分離速度快,樣品耗量9少,毛細(xì)管容易清洗,成本低等特點(diǎn),可以作為控制青葉膽藥材質(zhì)量的新型、快速、有效的分析方法。參考文獻(xiàn)1LIMei(李梅),YINMing-quan(尹明權(quán)),ZHAOLei(趙磊),etal.StudyonthegerminationcharacterofSwertiamileensisT.N.Hoet種成分基本提取完全。1012緩沖液濃度對分離的影響在一定范圍內(nèi)增加緩沖液離子強(qiáng)度可以改善柱效

19、,提高分離度。本實驗考察了硼砂濃度在2060mmolL范圍內(nèi)對分離的影響,發(fā)現(xiàn)隨著硼砂濃度的提高,各物質(zhì)分離度明顯改善,當(dāng)硼砂濃度為50mmolL時,獐牙菜苦苷電泳峰受電滲流峰的干擾較小,電泳遷移時間較為適宜。-l-lW.L.Shih(青葉膽種子發(fā)芽特性的研究).JYunnanAgricUniv(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報),2005,20(4):5932ChP(中國藥典).20051Vol(一部):136藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(12)3GUOAi-hua(郭愛華),LIJUN(李軍),FUHong-zheng(付宏2043(戴林東).Determinationofswe

20、rtiamarininSwertiamileensisT.N.HoetW.L.ShihbyUVspectrophotometry(分光光度法測定青葉膽征),etal.XanthonederivativesfrommedicinalplantSwertiamileensis(青葉膽酮類化合物的成分研究).ChinTraditHerbDrugs(中草內(nèi)獐芽菜苦甙含量).JLishizhenMedMaterMedRes(時珍國醫(yī)國藥),2000,12(11):10718ZHENGYi-min(鄭一敏),XUXiu-ying(胥秀英),FUShan-quan(傅善權(quán)).Contentdetermina

21、tionofswertiamarinandoleanolicacidinSwertiamileensisT.N.HeetW.L.Shihofdifferentparts(彌藥),2003,34(2):1074LIDong-mei(李冬梅),XIAOHuai(肖懷),LIUGuang-ming(劉光明).Advancesinstudiesonchemicalcompositionsandtheirphar2macologicaleffectintheplantsofSwertia(獐牙菜屬植物研究進(jìn)展).JDaliUniv(大理學(xué)院學(xué)報),2007,6(2):775AntognoniFabiana,ZhengSuiping,PagnuccoCristina,etal.InductionofflavonoidproductionbyUV-BradiationinPassifloraquadrangu2lariscalluscultures.Fitoterapia,2007,78(5):345勒獐牙菜藥材不同部位獐牙菜苦苷與齊墩果酸的含量測定).Chi