心肌細胞損傷模型的研究進展

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2、學與環(huán)境科學研究中心, 哈爾濱150076;2, 溫州325035摘要。由于各種心肌細胞模型的形成機制不同, 。本文結合自身的研究工作, 對國內(nèi)外心肌細胞損傷, 。關鍵詞; 損傷模型隨著生活水平的提高和人口老齡化, 同時受社會、環(huán)境等因素影響, 心血管疾病發(fā)病率逐年增加, 已成為人類死亡率最高的疾病之一。在心肌梗死, 缺血再灌注損傷等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中多伴有心肌細胞損傷, 進而發(fā)生細胞凋亡、鈣超載等, 引起心血管功能的紊亂。由于受血流動力學、激素、神經(jīng)反射的影響, 在體的心肌損傷模型很難準確地反映某些因子或因素在心肌細胞損傷中的作用。采用心肌細胞損傷模型能排除神經(jīng)、體液等因素的影響

3、, 所有的細胞處于均一環(huán)境中, 可以有效地觀察藥物對心肌細胞的直接作用, 并可對藥物的作用機制進行深入探討1。心肌細胞損傷模型在相關藥物作用機理、心臟毒理研究及新藥發(fā)現(xiàn)、新藥評價中已成為不可或缺的手段。目前主要采用的心肌細胞損傷模型有缺氧再給氧、H 2O 2、阿霉素等誘導的損傷模型。由于各種心肌細胞損傷模型的形成機制不同, 確定不同藥物對心肌細胞損傷模型的適用性對于藥物的研究具有重要的意義, 本文結合自身的研究工作, 對國內(nèi)外的心肌細胞損傷模型做一綜述, 為心血管藥物研究中心肌細胞損傷模型的客觀選擇提供參考。1缺氧再給氧損傷模型心肌梗死是心肌缺血性疾病中最嚴重的一種, 心肌缺氧/再給氧是模擬心

4、肌缺血再灌注損傷的心肌細胞損傷模型, 該模型可直接觀察藥物和不同條件處理對缺血再灌注損傷心肌細胞生理功能、生化代謝和形態(tài)結構等變化的影響, 同時可探討心肌缺血再灌注損傷及藥物作用的機制, 包括心肌細胞凋亡、鈣超載等。是目前應用最多的心肌細胞損傷模型。目前造成缺氧模型主要有物理缺氧法和化學缺氧法。1. 1物理缺氧法厭氧培養(yǎng)箱缺氧法厭氧培養(yǎng)箱是一種在無氧環(huán)境下進行細胞培養(yǎng)及操作的專用裝置, 能提供嚴格的厭氧狀態(tài)、恒定的溫度培養(yǎng)條件并具有系統(tǒng)化、科學化的工作區(qū)域, 具有厭氧環(huán)境好、密風性能好、溫控精度高、穩(wěn)定性好、使用方便、工作安全可靠等優(yōu)點。Park S 等人利用H 9C 2心肌細胞缺氧模型, 發(fā)

5、現(xiàn)洋蔥甲醇提取物0. 05g/ml 可以抑制ROS 升高、線粒體膜電位升高、細胞色素C 釋放和cas pase 23活化, 證明洋蔥甲醇提取物通過抗氧化途徑保護損傷H 9C 2心肌細胞2。在龍牙木總皂苷(A s 具有抗大鼠心肌缺血作用的前提下3, 孫桂波等人采用厭氧培養(yǎng)箱造成心肌缺氧模型, 以此模型驗證了A s 對缺氧再給氧損傷的心肌細胞亦具有保護作用4。自制厭氧罐缺氧法自制厭氧罐法具有經(jīng)濟、方便等優(yōu)點, 但需進行可控性、穩(wěn)定性研究方可進行實驗。Ki m HS 等利用該法, 研究乳鼠心肌細胞在缺氧的條件下, 通過影響凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的表達、膜電位及鈣離子變化等證明硫噴妥鈉具有心肌保護作用5

6、。葉錦霞等用自制厭氧罐使大鼠乳鼠心肌細胞缺氧3h 再給氧1h, 造成心肌細胞損傷模型, 檢測其生長、搏動功能、能量代謝、生物膜結構功能等都受到不同程度的損傷和破壞, 心肌酶LDH 釋放及心肌細胞內(nèi)MDA 、S OD 和GSH 2Px 的水平發(fā)生明顯的變化, 可較好地復制心肌缺血再灌注損傷及心肌細胞氧化應激狀態(tài)6, 7。1. 2化學缺氧法CoCl 2致心肌細胞缺氧法CoCl 2能引起類似缺氧/缺血的狀況810。CoCl 2可增加心肌細胞內(nèi)氧自由基的生成, 使心肌細胞內(nèi)抗氧化能力減弱, 產(chǎn)生氧化應激反應, 進而損傷線粒體的功能。該模型與臨床的心肌缺血差異較大, 因此應用較少。但CoCl 2誘導心肌

7、細胞凋亡可作為一種簡易、方便、實用的心肌細胞缺氧模型, 在深入探討低氧誘導的心肌細胞凋亡的調(diào)控機制及心肌細胞保護機制方面應用較多。W ang Y 等采用200? M18中藥藥理與臨床2010; 26(63基金項目:國家科技支撐計劃項目(No . 2008BA I 51B02 ; 國家重大創(chuàng)新藥(2009ZX09502-015 33 通訊作者的CoCl 2造成心肌細胞缺氧模型, 通過形態(tài)學、心肌酶學及凋亡相關指標來證明藥物對心肌細胞凋亡的影響11。廖新學等研究證明CoCl 2在400800mol/L濃度范圍內(nèi), CoCl 2處理H 9C 2心肌細胞36h, 呈劑量依賴性地降低細胞存活率; 在60

8、0mol/LCoCl 2處理H 9C 2心肌細胞前30m in, 應用400mol/LNaHS 可明顯地抑制CoCl 2對細胞的損傷作用, 使細胞存活率明顯升高, 細胞凋亡率及Cleaved Cas pase 23表達降低,并使H 9C 2心肌細胞內(nèi)GSSG/(GSH +GSSG 比值及ROS 水平明顯降低, 同時明顯地改善MM P 12。疊氮鈉(Na N3 致心肌細胞缺氧法疊氮鈉(Na N3 是線粒體有氧呼吸鏈細胞色素C 氧化酶(cyt ochr ome C oxidase,COX 特異性抑制劑, 通過對C OX 的抑制, 使線粒體有氧氧化磷酸化異常, 有氧呼吸鏈受阻。隨著疊氮鈉濃度和作用時

9、間的增加, 疊氮鈉對心肌細胞的死亡率明顯增加, 復13。利用Na N3刺激對心肌細胞的影響Guan F AM PK 通路的激活14。2過氧化氫損傷模型活性氧是細胞氧化呼吸代謝必需的產(chǎn)物, 通常僅占1%4%, 生物體的氧化和抗氧化系統(tǒng)可維持活性氧的代謝平衡。過氧化氫(H 2O 2 是一種重要的氧自由基(ROS , 大量堆積可導致包括心肌細胞在內(nèi)的多種細胞發(fā)生一系列生化反應。在代償范圍內(nèi), ROS 對心肌造成的損傷是可以恢復的, 而超過一定限度, 將造成包括心肌細胞壞死和凋亡在內(nèi)的不可逆轉(zhuǎn)損傷15。因此, 對于活性氧作用后細胞功能及其靶器官損傷的研究就顯得尤為重要。動物實驗及臨床觀察均可見到缺血再

10、灌注損傷中有心肌細胞凋亡發(fā)生, 并伴有過量的ROS 產(chǎn)生16。由于在多種疾病中伴有氧化應激17, 且H 2O 2方便易得, 應用方便, 因此多利用該模型進行具有抗氧化作用藥物的研究。但過氧化氫不穩(wěn)定易分解, 通常在pH 值為3. 54. 5時最穩(wěn)定, 在堿性溶液中極易分解, 在遇強光, 特別是短波射線照射時也能發(fā)生分解。因此試驗模型的穩(wěn)定是造模的關鍵, 而過氧化氫是模型穩(wěn)定的關鍵影響因素。L iang Q 等人利用H 2O 2誘導的心肌細胞損傷模型, 證明刺五加皂甙對心肌細胞氧化應激損傷有保護作用18。L i L 等人采用H 2O 2損傷的新生大鼠心肌細胞, 建立氧化應激損傷模型, 證明青藤堿

11、能抑制心肌細胞凋亡, 其機制可能與抑制心肌細胞NF 2k B 蛋白表達有關19。3阿霉素損傷模型阿霉素(Adria mycin, ADR 屬蒽醌類抗生素, 是臨床常用的高效、廣譜抗腫瘤藥20, 然而, ADR 具有明顯心臟毒副作用, 表現(xiàn)為用藥早期出現(xiàn)各種心律失常, 長期用藥較易引起充血性心力衰竭, 嚴重限制其臨床應用21。多年來, ADR 的心臟毒性一直是藥物毒理學研究領域的熱點課題, 但至今其誘發(fā)心臟毒性的機制仍未完全闡明, 多數(shù)研究集中在自由基、鈣超載、線粒體損害、阿霉素繼發(fā)代謝物, 但自由基理論為多數(shù)研究者所接受22, 23。ADR 與心肌組織的親和力明顯高于其他組織, 使得心肌組織更

12、易受到ADR 的損害24。ADR 進入心肌細胞后, 可通過多種途徑代謝, 并在代謝過程中產(chǎn)生自由基。ADR 在體內(nèi)誘導產(chǎn)生的自由基, 可逐漸消耗體內(nèi)的抗氧化物, 使機體抗氧化能力下降, 心肌細胞膜系統(tǒng)的不飽和脂質(zhì)過氧化, 改變膜通透性并形成新的鈣通道, 干擾細胞內(nèi)Ca 2+穩(wěn)態(tài), 激活肌漿網(wǎng)Ca 2+釋放通道25, 促使Ca 2+大量內(nèi)流。同時破壞線粒體結構, 干擾氧化磷酸化, 加速ATP 等高能磷酸化合物的耗竭, 使依賴能量的離子活性降低, 導致一系列的生化及病理變化, 最終引起心肌細胞損傷, 造成心功能紊亂H 9C 2或原用, 。等人采用2M 的H 9C 2細, MDA 的生成和細胞內(nèi)鈣離

13、, Bax 蛋白高表達, 增加Bcl 22基因和蛋白的表達, 降低線粒體膜電位26。L iu J 等人對阿霉素損傷H 9C 2心肌細胞模型進行了研究, 研究表明, 隨著阿霉素作用時間的延長, 其cas pase 23、29、P ARP 蛋白表達顯著增加, 信號通路蛋白ERK1/2及p53的表達也明顯增加, Bcl 22家族蛋白也有顯著變化, T UNE L 形態(tài)學檢測其改變也較明顯27。4其他心肌損傷模型4. 1氯化鎘(CdCl 2 鎘是人體非必需元素、廣泛存在的環(huán)境污染物, 且有蓄積性, 在人體內(nèi)半衰期長達1630年, 已被國際癌癥研究協(xié)會(I A RC 定為A 級致癌物, 即人類致癌物28

14、。同時, 鎘也是認定的環(huán)境心血管毒物。由于心肌細胞是終末分化細胞, 不具有再生能力, 即使鎘在其他臟器中的濃度高于心臟, 也可能造成心臟不可逆的損傷, 由于其蓄積作用, 即使輕微的損傷也能引起心肌細胞丟失從而造成心臟泵功能不可逆的降低, 因而在鎘的濃度和作用時間達到一定程度時, 細胞表現(xiàn)以壞死為主, 這種損傷將是致命性的。研究證實, 鎘能引起多種臟器損傷29。而心臟對于鎘的毒性作用更加敏感, 低劑量的鎘就能引起心肌細胞損傷, 鎘對心臟的毒性作用劑量要比報道的肝、腎的劑量低100倍30。ChoiMK 等研究證明CdCl 2能引起心肌細胞H 9C 2核染色質(zhì)濃縮, 出現(xiàn)DNA 梯度, 并且能增高C

15、as pase 23活性, 說明CdCl 2是通過引起H 9C 2凋亡而導致細胞死亡的31。該模型的研究多為鎘的心臟毒性及機制研究。4. 2三氧化二砷(A s 2O 3 三氧化二砷(arsenic tri oxide, A s 2O 3 俗稱砒霜, 但它在惡性腫瘤治療方面展示出良好的應用前景。近年來用其治療白血病和實體瘤獲得成功, 但它往往導致很嚴重的心律失常, 主要是通過改變各種離子在心臟動作電位復極而至心律失常。A s 2O 3在臨床治療中表現(xiàn)出的心臟不良反應也引起人們關注。Zhao X 等人研究了A s 2O 3誘導的心肌細胞H 9C 2損傷模型, 證明其可能是通過活化cas pase

16、23途徑、引發(fā)活性氧物種的形成和細胞內(nèi)鈣離子超載而成的32。Raghu K . G 等人用A s 2O 3作用于原代乳鼠心肌細胞, 通過檢測細胞活力、線粒體和脫氧核糖核酸的完整性、活性氧的產(chǎn)生、鈣超載和細胞凋亡等指標, 證明三氧化二砷引起心肌細胞生成活性氧和鈣超載而誘導細胞凋亡33。相繼發(fā)現(xiàn)A s 2O 3對心肌細胞膜的L 2型鈣電流(I Ca 2L 和外向整流鉀電流(I K 也有影響34, 35。近年來有利用該模型進行藥物減毒作用的研究, 如Zhao XY 36等人報28中藥藥理與臨床2010; 26(6 道, 證明白藜蘆醇通過減少ROS 的產(chǎn)生、降低細胞內(nèi)鈣積累和抑制cas pase 23

17、活化對A s 2O 3誘導的H 9C 2細胞凋亡產(chǎn)生保護作用。4. 3哇巴因哇巴因(ouabain 屬于強心甾類物質(zhì), 是一種具有Na +, K +2ATP 酶抑制作用的心臟糖苷, 各種證據(jù)提示循環(huán)中內(nèi)源性哇巴因水平升高與高血壓、心力衰竭及心律失常等各種心血管疾病密切相關37, 38, 作為一種內(nèi)循激素哇巴因在生理濃度下參與維持內(nèi)皮細胞的正常代謝增殖, 原發(fā)性高血壓等, 病理狀態(tài)下體內(nèi)哇巴因水平升高, 這種病理濃度的哇巴因?qū)?nèi)皮細胞的作用是抑制增殖, 引起凋亡。Huang L 等人在原代培養(yǎng)的心肌細胞中, 加入哇巴因后, 刺激細胞進行肥大型生長, 同時檢測到細胞中肥大標志性基因轉(zhuǎn)錄的增加, 而

18、且這種作用依賴Na +, K +2ATPase 的信號功能, 有幾種信號途徑交叉起作用39。該模型可做為篩選抗心律失常藥物的細胞模型, 作用機制的研究。4. 4烏頭堿, , 其。烏頭堿的主要, 因此采用烏頭堿治療疾病時需尋找其它藥物配伍進行減輕或降低烏頭堿毒性。建立烏頭堿心肌細胞損傷模型是實驗篩選保護心肌藥物的一種良好途徑。Fu M 等人做了烏頭堿對心肌細胞的損傷機制的研究, 結果表明烏頭堿誘發(fā)的異常主要表現(xiàn)在其自發(fā)搏動頻率、自發(fā)振蕩和細胞內(nèi)鈣離子濃度的相對幅度, 再通過加通道抑制劑證明心臟興奮收縮偶聯(lián)是烏頭堿誘發(fā)心律失常引起心肌細胞毒性的關鍵機制40。董 等在研究人參皂苷Rb1和Re 對烏頭

19、堿所致心肌細胞損傷的保護作用時, 觀察得到兩種皂苷與烏頭堿配伍具有減毒增效的作用, 此作用與人參皂苷減輕了烏頭堿所致的心肌細胞損傷和改善鈣離子通道異常表達有關41。5展望離體培養(yǎng)心肌細胞具有完善的生理功能及電生理特性, 避免了全身神經(jīng)體液、激素水平及局部不同類型細胞間的相互影響, 而且最大限度的克服了個體差異, 具有很強的特異性。采用心肌細胞可復制多種模型, 并具有良好的穩(wěn)定性、重復性, 在藥物篩選及機制研究中發(fā)揮了重要的作用。心肌細胞缺氧及再給氧損傷模型是目前應用最多的心肌細胞損傷模型, 物理缺氧模型一般采用缺氧36h, 化學缺氧模型一般為缺氧24h 48h, 可看出物理缺氧模型較化學缺氧模

20、型省時, 而且物理缺氧模型操作簡便、可控性強, 化學缺氧模型易受化學藥物不穩(wěn)定及濃度等因素的影響。物理缺氧模型更便于新藥物開發(fā)及藥物保護方面的研究。另外體外培養(yǎng)心肌細胞缺氧再給氧損傷模型不能只單純地造成心肌缺氧, 還應造成缺糖模型模擬臨床的缺血狀態(tài), 否則單純地缺氧不能完全等同于心肌缺血再灌注損傷, 這在評價藥物的藥效和作用機制時, 應予以注意。H 2O 2心肌細胞損傷模型和阿霉素心肌細胞損傷模型機理均與氧化應激性損傷相關, 但二者又有著不同之處。H 2O 2是細胞內(nèi)呼吸代謝的必需產(chǎn)物, 當H 2O 2在體內(nèi)大量堆積時, 即可導致包括心肌細胞在內(nèi)的多種細胞發(fā)生相關反應, 動物實驗及臨床觀察也發(fā)

21、現(xiàn)多種心血管疾病中均伴有活性氧的產(chǎn)生, 因此可利用H 2O 2損傷心肌細胞模型研究藥物的直接抗氧化作用。而阿霉素是臨床常用的抗腫瘤藥, 由于其易產(chǎn)生一些心臟毒性, 人們多采用阿霉素心肌細胞損傷模型來尋找具有抗阿霉素引起心肌損傷同時又不降低阿霉素抗腫瘤活性作用的藥物。各種心肌細胞損傷模型由于作用時間等處理條件的不同, 損傷程度不同, 因此, 在研究中要根據(jù)實驗目的進行條件的優(yōu)選。如心肌細胞凋亡模型, 必須選擇特異性的凋亡指標檢測才能建立穩(wěn)定的心肌細胞凋亡模型。多種心血管疾病或某些藥物、毒物都可能通過不同方法造成心肌損傷, 各模型均根據(jù)不同機制, , 不、, 心肌細胞培養(yǎng), , , 。參考文獻1徐

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