地塞米松對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響

1、    地塞米松對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)型 一氧化氮合酶表達(dá)的影響        摘要：目的觀察內(nèi)毒素誘導(dǎo)對體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮（NO）及其誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達(dá)的變化，以及地塞米松（DEX）對其的影響。方法采用Griess法和半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法，對正常、內(nèi)毒素誘導(dǎo)后及加入DEX的內(nèi)毒素誘導(dǎo)后大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞NO及其iNOS mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果（1）內(nèi)毒素誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NO產(chǎn)生增加，且呈內(nèi)毒素劑量

2、和時間依賴性；（2）DEX對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NO產(chǎn)生有抑制作用；（3）內(nèi)毒素能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)，而DEX對其具有抑制作用。結(jié)論內(nèi)毒素能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的表達(dá)，DEX對其具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制是通過抑制iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的。關(guān)鍵詞：星形細(xì)胞；一氧化氮合酶；地塞米松The effect of dexamethasone on the expression of inducible nitric oxide synthase in rat astrocytesGAO Feng(Department of Neurology, Childrens Hos

3、pital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003, China)SHUI Quanxiang(Department of Neurology, Childrens Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003, China)Abstract：ObjectiveTo explore the change of nitric oxide (NO), the mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) induc

4、ed by endotoxin in cultured rat astrocytes, and the effect of dexamethasone on it. MethodsNO was detected by Griess method and iNOS mRNA expression was semiquantitated by RT-PCR techniques in normal astrocytes, endotoxin induced astrocytes and dexamethasone treated endotoxin induced astrocytes. Resu

5、lts（1） NO increased in a dose and time-dependent manner when cells were induced by endotoxin. （2） Dexamethasone inhibited the production of NO induced by endotoxin in astrocytes. （3） The iNOS mRNA was expressed in astrocytes by endotoxin inducement, and down-regulated by dexamethasone. ConclusionEnd

6、otoxin could stimulate the release of NO and the expression of iNOS mRNA in rat astrocytes, which could be down-regulated by dexamethasone. The mechanism might contribute to the inhibition of iNOS mRNA transcription. Key words：Astrocytes; Nitric-oxide synthase; Dexamethasone近年來，隨著對一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NO

7、S）研究的深入，已證明體內(nèi)有多種細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等）能夠產(chǎn)生NOS，但是有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞NOS尤其是誘導(dǎo)型NOS（iNOS）的研究報道尚不多見。我們以內(nèi)毒素成分脂多糖（LPS）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NO、iNOS mRNA的表達(dá)以及地塞米松（DEX）對其影響進(jìn)行研究。材料和方法一、細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)1的方法，在無菌條件下，取02 d的SD大鼠的大腦皮層，剔除軟腦膜及血管，在37條件下，用0.125%胰蛋白酶消化30 min，加入含20%小牛血清的達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)液（DMEM）中止胰酶消化，經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)篩過濾，利用差速粘附純化單細(xì)胞懸液后，以108/L的密度接種至預(yù)先

8、涂布有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中。 培養(yǎng)條件為37、5% CO2。培養(yǎng)液成分為DMEM和小牛血清。每隔23 d換液1次，待原代細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后去除舊培養(yǎng)液，加入0.125%胰蛋白酶，37消化10 min，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞從瓶壁脫落，收集細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)板或有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)。二、星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定間接熒光抗體染色法：將長有細(xì)胞的蓋玻片經(jīng)丙酮固定10 min，PBS洗3 min，共3次。1160兔抗、DEX為10-7 mol/L鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）抗血清（Sigma產(chǎn)品），37，40 min，PBS洗3 min，共3次。1100稀釋羊抗兔IgG-FITC（Sig

9、ma產(chǎn)品），37，40 min，PBS洗3 min，共3次。0.1伊文蘭襯染35 min，PBS洗2 min，共3次，緩沖甘油封片，最后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。三、實驗分組經(jīng)傳代的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈融合狀態(tài)后，吸去含血清的培養(yǎng)液，Hanks液洗滌后，分別加入含不同濃度的LPS（Sigma產(chǎn)品）或（和）DEX的無血清DMEM（無酚紅）中繼續(xù)培養(yǎng)。將實驗分為3組：（1）對照組；（2）LPS組；（3）LPSDEX組；每點(diǎn)作5個復(fù)孔。于不同時間收集上層培養(yǎng)液，-20保存，待測NO，細(xì)胞層抽提RNA。四、NO的測定以NO的穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物-亞硝酸鹽作為檢測NO的指標(biāo)，用Griess法試劑盒（美國Promega公

10、司）測定，嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書操作。五、iNOS mRNA的表達(dá)1.cDNA引物由上海生工生物工程所合成。iNOS cDNA引物序列：（1）5-CTGCATGGAACAAGT ATAAGGCAAAC-3；（2）5-CAGACAGTTTCTGGT CGATGTCATGA-3，反應(yīng)產(chǎn)物229 bp。-actin cDNA引物序列 ：（1）5-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3；（2）5-CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC-3，反應(yīng)產(chǎn)物540 bp。-actin用作被檢RNA樣本質(zhì)和量的對照。2.RNA的抽提：用Tripure法分離試劑盒（德國寶靈曼公司）抽提RNA，嚴(yán)格按說明書

11、操作。3.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）過程：用一管法RT-PCR試劑盒（德國寶靈曼公司），在同一試管中進(jìn)行（50 l反應(yīng)體積內(nèi)）RT- PCR：4種dNTP 各200 mol/L，引物濃度各0.4 mol/L，DTT溶液5 mmol/L，5×RT-PCR反應(yīng)液(1.5 mmol/L MgCl2)，樣本RNA 1 g，混合酶1 l，RNA酶抑制劑10 U，無RNA酶水補(bǔ)至總反應(yīng)體系為50 l。反轉(zhuǎn)錄條件：55，30 min 。PCR條件：94，2 min；94，30 s、55，30 s、68，1 min；共35個循環(huán)，最后68 7 min。4.結(jié)果觀察：反應(yīng)產(chǎn)物20 l加上樣緩

12、沖液（含溴酚蘭等）2 l ，與PCR 標(biāo)記一起在2瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠0.5 g/ml）電泳（50 V，3 h），紫外線燈下觀察結(jié)果并攝像。膠片經(jīng)光密度掃描儀掃描iNOS cDNA與-actin cDNA陽性條帶，結(jié)果以兩者的吸光度比值表示。六、統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用計算機(jī)統(tǒng)計軟件(spss 7.5 for windows)對數(shù)據(jù)進(jìn)行F、q及t檢驗。結(jié)果一、星形膠質(zhì)細(xì)胞NO產(chǎn)生的變化傳代后的細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光染色為陽性。星形膠質(zhì)細(xì)胞不加LPS，僅加不含小牛血清的DMEM中培養(yǎng)36 h后，能測得一定量的NO（0.7±0.5）mol/

13、L。加入LPS后，隨LPS濃度增高，NO產(chǎn)生隨之增加LPS濃度為0.01、0.1和1 mg/L時，NO分別為(7.9±1.9)、(17.6±3.0)和(27.2±3.9) mol/L。LPS濃度為10 mg/L時NO達(dá)到高峰（40.0±2.5）mol/L(不同濃度間比較F值=177.72，P<0.001）。星形膠質(zhì)細(xì)胞分別加入LPS或LPSDEX不同時間后，可見NO隨培養(yǎng)時間延長而增高，12 h后尤為明顯。12 h后對照組、LPS組、LPSDEX組各時間點(diǎn)之間差異均有顯著意義（表1）。表1對照組、LPS組和LPS+DEX組不同培養(yǎng)時間對星形膠質(zhì)細(xì)胞

14、NO產(chǎn)生的影響（±s，mol/L）組別培養(yǎng)時間（h）不同時間比較F值0312243648對照組3.8±1.03.3±1.14.2±1.55.3±1.23.7±1.23.4±1.80.87LPS+DEX組2.5±0.54.9±0.45.5±1.212.8±1.0*16.9±2.2*21.7±1.2*109.16*LPS組3.3±1.06.0±0.5*6.9±0.5*27.7±1.5*29.2±6.1*29.4±

15、;1.6*111.67*不同組間比較F值2.7210.82*6.94*321.42*56.08*470.54*注：與對照組比較，* P<0.05；* P0.05；與LPS+DEX組比較， P0.01；LPS為5 mg/L 不同濃度DEX對NO產(chǎn)生有明顯的影響，LPS濃度為5 mg/L，培養(yǎng)24 h時，NO產(chǎn)生隨DEX濃度的升高(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L)而逐漸降低NO分別為（29.8±8.4）、（30.3±1.5）、（22.2±6.5）、（15.2±1.3）、（13.6±1.3）和（14.4

16、±1.8）mol/L，不同濃度間比較F=14.32、P<0.001。二、星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)用RTPCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激后培養(yǎng)的不同時間的結(jié)果表明：0 h iNOS mRNA不表達(dá)，3 h已可見表達(dá)，于12 h表達(dá)明顯增高，并達(dá)高峰，24 h表達(dá)下降。雖然LPS+DEX組也可見iNOS mRNA表達(dá)，但較同時間LPS組的強(qiáng)度明顯減弱（表2、1）。表2星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時間iNOS mRNA的表達(dá)(±s)組別iNOS/-actin積分光度比值不同濃度間比較F值3 h12 h24 hLPS組0.49±0.070.88±0.07

17、0.76±0.0722.69*LPS+DEX組0.29±0.070.63±0.050.36±0.0919.20*兩組間比較t值4.04*7.02*5.01* P0.05，* P0.01；LPS為5 mg/L，DEX為10-7 mol/L注：A: PCR標(biāo)記；B: 對照組；C: 0 h LPS；D: 3 h LPS；E: 3 h LPS+DEX；F: 12 h LPS；G: 12 h LPS+DEX；H: 24 h LPS；I: 24 h LPS+DEX1星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時間iNOS mRNA的表達(dá)（LPS為5 mg/L、DEX為10-7mol/L）討論近

18、年來的研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞除具有支持、營養(yǎng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、合成神經(jīng)活性物質(zhì)等功能外，還具有免疫細(xì)胞的功能，與其他外周免疫細(xì)胞一樣能夠分泌、合成炎性細(xì)胞因子，表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物（MHC），參與了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程2、3。哺乳動物體內(nèi)NOS至少可分為3種類型：神經(jīng)元性、內(nèi)皮細(xì)胞性和誘導(dǎo)性，三者的核苷酸和氨基酸序列約50是同源性的。已經(jīng)證明巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等在內(nèi)毒素和細(xì)胞因子等誘導(dǎo)刺激下能夠激活iNOS。而iNOS介導(dǎo)的NO主要作為細(xì)胞毒性和免疫信息分子，具有殺傷、清除和免疫調(diào)節(jié)作用。同時，也引起組織、細(xì)胞損傷等病理過程4。本研究以NO的穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物-亞硝酸鹽作為檢測NO和iNOS

19、活性的指標(biāo)。結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)菌成分LPS的刺激下，NO產(chǎn)生增加，呈LPS劑量和時間依賴性，結(jié)果與Park等5研究的相一致。LPS作用后 312 h可見NO少量增高，24 h后明顯增加。由于體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中刺激原的持續(xù)存在和無清除NO的場所，因此，NO隨時間依賴性增加。 糖皮質(zhì)激素具有抗炎作用，能夠抑制炎性細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子（TNF）、IL-6等細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)，DEX也能抑制受LPS刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞過度產(chǎn)生NO，這為我們臨床應(yīng)用DEX治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病提供了新的依據(jù)。我們應(yīng)用RTPCR方法證實星形膠質(zhì)細(xì)胞在靜息狀態(tài)下iNOS mRNA不表達(dá)，經(jīng)LPS刺激后表達(dá)

20、的峰值時間在12 h，以后明顯減弱。說明LPS對星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的誘導(dǎo)是首先通過mRNA的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的6。從LPS刺激后iNOS mRNA表達(dá)的時間曲線看，與Park等7以Northern blotting方法證明iNOS mRNA表達(dá)的峰值時間在48 h不一致。兩者在時間上的差異，可能是因為方法學(xué)的不同所致。Northern blotting法比本研究所采用的半定量RT-PCR法更適于定量分析。本研究還發(fā)現(xiàn)DEX能明顯減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)，這一結(jié)果提示了DEX對iNOS的表達(dá)也是通過分子機(jī)制調(diào)節(jié)的。總之，細(xì)菌內(nèi)毒素LPS能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的表達(dá)，且呈時間和劑量依

21、賴性。DEX對其具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，這種作用可能是通過抑制iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的。（本文編輯：魏均民）基金項目：浙江省衛(wèi)生廳基金資助項目（98A056）；浙江省教委基金資助項目（97069）作者單位：高峰(杭州，浙江醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)科神經(jīng)組310003)水泉祥(杭州，浙江醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)科神經(jīng)組310003)參考文獻(xiàn)：1薛慶善, 郭畹華. 大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其促神經(jīng)突起生長作用研究. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1996，12：151-155. 2Montgomery DL. Astrocytes： form， function and roles in disease. Vet Pathol, 1994： 31, 145-167. 3