酪蛋白的提取與測(cè)定

1、牛乳中酪蛋白得制備與濃度測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)從牛乳中分離酪蛋白得原理與方法、掌握等電點(diǎn)沉淀法提取蛋白質(zhì)得方法3、了解紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度得原理,熟悉紫外分光光度計(jì)得使用4、學(xué)會(huì)用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度二、實(shí)驗(yàn)原理1、準(zhǔn)備酪蛋白原理 :牛乳中主要含有酪蛋白與乳清蛋白兩種蛋白質(zhì) ,其中酪蛋白占了牛乳蛋白質(zhì)得 80%、牛乳在 PH。 7 時(shí)酪蛋白等電聚沉后剩余得蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為乳清蛋白、酪蛋白就是白色、無(wú)味得物質(zhì) ,不溶于水、乙醇等有機(jī)溶劑 ,但溶于堿溶液。 乳清蛋白不同于酪蛋白 ,其粒子得水與能力很強(qiáng) ,分散性高 ,在乳中呈高分子狀態(tài)。本法利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低得原理 ,將牛乳得 PH

2、 調(diào)至 4。時(shí) , 酪蛋白就沉淀出來(lái)。用乙醇洗滌沉淀物 ,除去脂類雜質(zhì)后便可得到純得酪蛋白。2、紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度得原理 :大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有酷氨酸與色氨酸得存在 ,在紫外光 280nm 有吸收高峰 ,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量得測(cè)定。 但就是核酸在 80nm 也有吸收 ,干擾測(cè)定 ,不過(guò)核酸得最大吸收峰在 0nm,通過(guò)測(cè)定在 28 nm 與 260時(shí)得比值 ,然后通過(guò)計(jì)算消除核酸存在得影響 ,可以求得有核酸存在時(shí)蛋白質(zhì)得濃度。3、考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度原理 :考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)得疏水微區(qū)相結(jié)合 ,這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán) 250 得磷酸溶液呈棕紅色 ,最大吸收峰在 465nm

3、、當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色 ,其最大吸收峰改變?yōu)?5 5n,考馬斯亮藍(lán) G 5蛋白質(zhì)復(fù)合物得高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測(cè)定得高敏感度。在一定范圍內(nèi) ,考馬斯亮藍(lán) G250蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后 ,在 595nm 下,吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系 ,故可以用于蛋白質(zhì)濃度得測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、制備酪蛋白 :燒杯、玻璃棒、量筒、精密 PH 試紙、離心機(jī)、布氏漏斗、表面皿、恒溫水浴鍋牛奶、醋酸緩沖液、冰醋酸、9%乙醇、無(wú)水乙醚、紫外光吸收法 :紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9Nal、 1 o LNaOH 溶液、 1ol/ 乙酸溶液3、考馬斯亮藍(lán)法

4、:紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、試管 1 5cm× 5cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白 (0.1g l) 、考馬斯亮藍(lán)、 0。 9% aCl四、實(shí)驗(yàn)步驟制備酪蛋白1、將 20mL pH。得醋酸 -醋酸鈉緩沖液預(yù)熱至40、將 2牛奶加熱至 0 ,在攪拌下緩慢地加入20 L 預(yù)熱得 H4。7 得醋酸 醋酸鈉緩沖液3、用精密 pH 試紙調(diào) p至 4.7,可見(jiàn)溶液變?yōu)槿榘咨珣腋∫骸⒋龖腋∫豪鋮s至室溫,400 m 離心 5min,棄上清 ,得酪蛋白粗制品5、用蒸餾水洗沉淀3 次 ,3000rm 離心 5min,棄上清6、在沉淀中加入 20m 5乙醇 ,攪拌片刻 ,將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏

5、斗中抽濾7、用乙醇 乙醚混合液洗滌沉淀 2 次(1ml 次 ),最后用乙醚洗滌沉淀 2 次(1 m/次 ),抽干8、將沉淀攤開(kāi)在表面皿上,風(fēng)干 ,得酪蛋白純品、準(zhǔn)確稱量 ,計(jì)算含量與得率紫外光吸收法 .取待測(cè)樣品溶液置于得石英比色皿中 ,于分光光度計(jì)波長(zhǎng) 80 m 與260nm,分別讀取 A 8 nm 與 A20nm,用生理鹽水為比色空白對(duì)照。2.若 A280nm/A 60nm>、 5,用公式 :蛋白質(zhì)含量 ( g/l)=A 8 n 6、31若 A 80m/2 n<1。5,用公式 :蛋白質(zhì)含量 (gml) 4 280nm 0。 7 260nm考馬斯亮藍(lán)法取支干凈試管 ,按表進(jìn)行編號(hào)并加入試劑、混勻 ,室溫靜置 mi ,以第 1 管為空白 ,于波長(zhǎng) 95nm 處比色 ,讀取吸光度 , 以吸光度為縱坐標(biāo) ,各標(biāo)準(zhǔn)液濃度 ( g/m)作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)酪蛋白質(zhì)量 :0.421g酪蛋白含量 :.7g/ l 牛乳紫外光吸收法 :280m 076AA 260n0.5280nm/ 60 m<1。5,蛋白質(zhì)含量 (mg/ml)= 。 A 280 m . 4 260nm =0、 405m/ml考馬斯亮藍(lán)法管號(hào)1(空 2357白 )標(biāo)準(zhǔn)蛋白液00、 1 。0.30。0、 60.8-ml樣品 ml-110.9%N 10、 90。0、7、60。 40、20/考馬斯亮