實驗九：雞胚成纖維細胞的制備

1、實驗九實驗九 雞胚成纖維細胞的制備雞胚成纖維細胞的制備一、實驗目的一、實驗目的學習和掌握雞胚成纖維細胞的制備和培養(yǎng)方法；學習和掌握雞胚成纖維細胞的制備和培養(yǎng)方法；了解原代細胞培養(yǎng)的原理和方法。了解原代細胞培養(yǎng)的原理和方法。二、試驗器具、試劑、儀器二、試驗器具、試劑、儀器 超凈工作臺，檢卵燈，滅菌的細胞培養(yǎng)瓶、眼科剪、眼科超凈工作臺，檢卵燈，滅菌的細胞培養(yǎng)瓶、眼科剪、眼科鑷、平皿、吸管、離心管等；鑷、平皿、吸管、離心管等；9-11日齡雞胚；日齡雞胚；Hanks液，液，0.25%胰酶消化液，雙抗（胰酶消化液，雙抗（10000IU/ml青鏈霉素），青鏈霉素），7.5%NaHCO3溶液，溶液，DMEM

2、營養(yǎng)液，營養(yǎng)液，75%酒精棉。酒精棉。三、實驗原理三、實驗原理 病毒能在易感的組織或單層細胞內(nèi)增殖，并可病毒能在易感的組織或單層細胞內(nèi)增殖，并可產(chǎn)生細胞病變，因此，細胞培養(yǎng)是病毒學研究的重產(chǎn)生細胞病變，因此，細胞培養(yǎng)是病毒學研究的重要手段，是進行病毒性疫苗生產(chǎn)和病毒性疾病診斷要手段，是進行病毒性疫苗生產(chǎn)和病毒性疾病診斷必不可少的工具。原代細胞培養(yǎng)是體外制備細胞培必不可少的工具。原代細胞培養(yǎng)是體外制備細胞培養(yǎng)物的必經(jīng)過程，從供體體內(nèi)取出組織分散成單個養(yǎng)物的必經(jīng)過程，從供體體內(nèi)取出組織分散成單個細胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng)，從初次培養(yǎng)到第細胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng)，從初次培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)為原

3、代培養(yǎng)。一次傳代培養(yǎng)為原代培養(yǎng)。 本實驗以雞胚成纖維細胞作為原代細本實驗以雞胚成纖維細胞作為原代細胞，通過細胞培養(yǎng)實踐操作，認識和體胞，通過細胞培養(yǎng)實踐操作，認識和體會原代細胞的制備方法和影響細胞培養(yǎng)會原代細胞的制備方法和影響細胞培養(yǎng)的主要因素，并掌握原代細胞培養(yǎng)的方的主要因素，并掌握原代細胞培養(yǎng)的方法。法。四、實驗步驟四、實驗步驟 （一）操作前的準備（一）操作前的準備1、預熱培養(yǎng)液：把已經(jīng)配制好的生長液、預熱培養(yǎng)液：把已經(jīng)配制好的生長液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入液和胰蛋白酶液放入37水浴鍋內(nèi)預熱；水浴鍋內(nèi)預熱；2、用、用75%酒精棉擦拭雙手和紫外線照射過的超凈酒精棉擦拭雙手和紫外線照射

4、過的超凈 工作臺；工作臺；3、正確擺放要使用的器械：保證足夠的操作空、正確擺放要使用的器械：保證足夠的操作空 間，不僅便于操作而且可減少污染；間，不僅便于操作而且可減少污染；4、點燃酒精燈、點燃酒精燈.（二）雞胚成纖維細胞的制備（二）雞胚成纖維細胞的制備1、雞胚的處理、雞胚的處理（1）蛋殼消毒）蛋殼消毒 取取9-11日齡的雞胚，用檢卵燈選取血管清楚、日齡的雞胚，用檢卵燈選取血管清楚、活動正常的雞胚，置蛋架上，令氣室端向上，活動正常的雞胚，置蛋架上，令氣室端向上，75%酒精棉消毒蛋殼氣室部位。酒精棉消毒蛋殼氣室部位。（2）胚體采集）胚體采集 以鑷子擊破卵殼氣室部位，并除去該部位卵殼。以鑷子擊破卵

5、殼氣室部位，并除去該部位卵殼。用無菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛用無菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛尿囊膜和羊膜，鉤住雞胚頭部，移入滅菌的平皿內(nèi)。尿囊膜和羊膜，鉤住雞胚頭部，移入滅菌的平皿內(nèi)。用剪刀剪去胚頭、四肢及內(nèi)臟，用用剪刀剪去胚頭、四肢及內(nèi)臟，用Hanks液洗去體液洗去體表血液，移入滅菌小燒杯中。表血液，移入滅菌小燒杯中。（3）胚體勻漿）胚體勻漿 用滅菌剪將胚體剪碎至用滅菌剪將胚體剪碎至1mm3小碎塊。加小碎塊。加入入Hanks液（淹住組織碎塊即可），輕搖，靜液（淹住組織碎塊即可），輕搖，靜置置1-2min，待組織塊下沉，吸去上層懸液。，待組織塊下沉，吸去上層懸液。重復

6、重復2-3次（以除去其中的紅細胞），至上懸次（以除去其中的紅細胞），至上懸液不混濁為止，移入滅菌的小三角瓶中，吸去液不混濁為止，移入滅菌的小三角瓶中，吸去Hanks液。液。2、分散細胞、分散細胞（1）胰酶消化）胰酶消化 取出預熱好的取出預熱好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入約胰酶，向三角瓶中加入約8mL。包緊瓶口，包緊瓶口，37消化消化30min，每隔，每隔5min輕輕搖動輕輕搖動1次。次。由于胰酶的作用，雞胚細胞與細胞間的氨基和羧基游由于胰酶的作用，雞胚細胞與細胞間的氨基和羧基游離。待液體變混而稍稠，輕搖可見組織塊懸浮在液體離。待液體變混而稍稠，輕搖可見組織塊懸浮在液體內(nèi)不易下沉，此時可中止

7、消化。如再繼續(xù)消化，可破內(nèi)不易下沉，此時可中止消化。如再繼續(xù)消化，可破壞細胞膜而不易貼壁生長，如果消化不夠，則細胞不壞細胞膜而不易貼壁生長，如果消化不夠，則細胞不易分散。易分散。（2）分散細胞）分散細胞 將消化好的細胞懸液從水浴鍋中取出，棄去上層將消化好的細胞懸液從水浴鍋中取出，棄去上層液體，加液體，加5mL含血清的含血清的DMEM生長液（生長液（DMEM營養(yǎng)液營養(yǎng)液+5%犢牛血清犢牛血清+100IU/ml青鏈霉素，用青鏈霉素，用7.5%NaHCO3溶液調(diào)溶液調(diào)pH7.2），以吸管反復吹吸數(shù)次，使細胞分散，），以吸管反復吹吸數(shù)次，使細胞分散，此時可見生長液混濁，即為細胞懸液。靜置此時可見生長液

8、混濁，即為細胞懸液。靜置1min后，后，使未沖散的組織塊下沉。使未沖散的組織塊下沉。（3）過濾）過濾 用用4層脫脂紗布將吹打后的細胞過濾到平皿中，層脫脂紗布將吹打后的細胞過濾到平皿中，收集濾液。收集濾液。（三）分裝與培養(yǎng)（三）分裝與培養(yǎng)1、細胞計數(shù)、細胞計數(shù) 用細胞計數(shù)器計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入用細胞計數(shù)器計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入DMEM生長液，調(diào)整細胞濃度至生長液，調(diào)整細胞濃度至50萬萬-60萬個萬個/ml。（本實驗省略此步）。（本實驗省略此步）2、分裝與培養(yǎng)、分裝與培養(yǎng) 在培養(yǎng)瓶中加入在培養(yǎng)瓶中加入2mLDMEM生長液生長液(如果是如果是50mL的培養(yǎng)瓶，加的培養(yǎng)瓶，加4mL生長液生長液)

9、，小心吸出過濾后的細胞懸液，小心吸出過濾后的細胞懸液0.25mL至培養(yǎng)瓶中（至培養(yǎng)瓶中（如果是如果是50mL的培養(yǎng)瓶，加的培養(yǎng)瓶，加0.5mL的細的細胞懸液胞懸液)，吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日，吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日期，置期，置37溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)(4h后細胞即可貼壁，后細胞即可貼壁，24-36h生長成單層細胞，此時可更換培養(yǎng)液，并接種生長成單層細胞，此時可更換培養(yǎng)液，并接種病毒病毒)。分裝后。分裝后2-4h不可大幅度移動培養(yǎng)瓶，以免不可大幅度移動培養(yǎng)瓶，以免影響細胞的貼壁和生長。本實驗培養(yǎng)影響細胞的貼壁和生長。本實驗培養(yǎng)3天，培養(yǎng)期天，培養(yǎng)期間可每天觀察間可每天觀

10、察1次。次。3天后取出，洗凈培養(yǎng)瓶，放天后取出，洗凈培養(yǎng)瓶，放回實驗室?；貙嶒炇?。（四）細胞形態(tài)觀察（四）細胞形態(tài)觀察 檢查時注意培養(yǎng)液的顏色變化，變黃但不混濁表檢查時注意培養(yǎng)液的顏色變化，變黃但不混濁表示有細胞生長，變紅表示細胞未生長或生長不佳。示有細胞生長，變紅表示細胞未生長或生長不佳。37培養(yǎng)培養(yǎng)24-48h后，于倒置顯微鏡下觀察，細胞可后，于倒置顯微鏡下觀察，細胞可以長成單層，細胞透亮，呈纖維狀，細胞膜清晰。以長成單層，細胞透亮，呈纖維狀，細胞膜清晰。五、注意事項五、注意事項1、整個過程嚴格無菌操作、整個過程嚴格無菌操作2、培養(yǎng)液不要太多，應有足夠的空間保證細胞對、培養(yǎng)液不要太多，應有足夠的空間保證細胞對 氧的需要氧的需要3、放入、放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，不要將蓋子擰得太培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，不要將蓋子擰得太 緊，并將緊，并將CO2濃度控制在濃度控制在5%4、一般、一般2d換一次培養(yǎng)液，細胞長成單層后要及換一次培養(yǎng)液，細胞長成