QKI蛋白的原核表達(dá)、 純化及其多克隆抗體的制備與鑒定(一)

1、QKI蛋白的原核表達(dá)、 純化及其多克隆抗體的制備與鑒定(一)    作者：黃博, 于芳, 王孝功, 白麗圓, 李華, 盧茲凡【關(guān)鍵詞】 QKI摘 要 目的: 獲得原核表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白QKI7蛋白, 并制備其兔抗QKI多克隆抗體。方法: 將成功插入QKI7編碼區(qū)cDNA的PET32b(+)原核表達(dá)載體用熱休克法轉(zhuǎn)化BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)菌, 以IPTG誘導(dǎo)6×HisQKI7融合蛋白的表達(dá), 分別經(jīng)金屬鰲合柱、 反向柱和強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行層析純化。經(jīng)SDSPAGE和Western blot鑒定后, 應(yīng)用純化的融合蛋白, 分別以弗氏佐劑、

2、聚丙烯酰胺凝膠、 NC膜作為佐劑免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體, 并以Western blot進(jìn)行檢測。結(jié)果: 經(jīng)表達(dá)并純化的QKI7蛋白純度達(dá)到95%以上, 應(yīng)用純化的融合蛋白以弗氏佐劑作為佐劑免疫新西蘭大白兔后獲得高滴度, 特異性的抗QKI的多克隆抗體。結(jié)論: 成功地表達(dá)并純化了QKI7蛋白, 并制備了高滴度、 高特異性的抗QKI多克隆抗體。采用弗氏佐劑作為免疫佐劑進(jìn)行免疫的效果優(yōu)于聚丙烯酰胺凝膠和NC膜。關(guān)鍵詞QKI7; 原核表達(dá); 蛋白純化; 多克隆抗體QKI是屬于STAR家族的一種RNA結(jié)合蛋白,在進(jìn)化過程中高度保守, 在神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成、 胚胎發(fā)育、 心血管系統(tǒng)的發(fā)育等方面起著重

3、要的作用。qki基因不同部位的突變體小鼠可以表現(xiàn)在出生前死于心血管肌肉系統(tǒng)發(fā)育障礙, 或于出生后10 d表現(xiàn)為快速的震顫以及到了成年強(qiáng)直性驚厥的發(fā)作1-3。Pilotte 等4發(fā)現(xiàn)QKI7可以引起成纖維細(xì)胞和原代培養(yǎng)的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡, QKI5 和QKI6不但不能誘導(dǎo)凋亡, 反而可以與QKI7形成二聚體, 并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi), 抑制QKI7的致凋亡作用。為了研究QKI在外界不同信號刺激下在炎癥發(fā)生、 血管生成過程中表達(dá)水平的變化, 我們表達(dá)和純化了6×HisQKI7融合蛋白, 并制備了高特異性的多克隆抗體5。同時(shí)還比較了利用3種不同的免疫佐劑制備QKI多克隆抗體的效果。1 材

4、料和方法1.1 材料 6×His融合表達(dá)載體PET32b(+)QKI7含有編碼QKI7 cDNA序列, 由美國Emory大學(xué)藥理系教授馮越惠贈。Ni金屬鰲合柱（Sepharose Fast Flow）、 反相層析柱（source 30RPC）和強(qiáng)陰離子柱（source 30Q）均購自Pharmacia 公司。純種新西蘭白兔由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。弗氏佐劑購自Gibco BRL 公司。HepG2細(xì)胞、 Hy906細(xì)胞為本室保存的引自美國ATCC的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株。1.2 方法1.2.1 細(xì)菌的發(fā)酵和裂解 將6×His融合表達(dá)載體PET32b(+)QKI7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE

5、3)接到5 mL的LB培養(yǎng)基中, 30培養(yǎng)過夜, 轉(zhuǎn)接細(xì)菌到500 mL 2×YT培養(yǎng)基中, 30培養(yǎng)10 h無菌接種于30 L發(fā)酵罐中（內(nèi)有8 L培養(yǎng)液, 不含抗生素）37培養(yǎng)6 h后開始流加補(bǔ)料, 9 h后加入IPTG至終濃度05 mmol/L開始誘導(dǎo), 誘導(dǎo)4 h后停止發(fā)酵。4000 r/min離心25 min, 收集沉淀, -70保存?zhèn)溆?。取發(fā)酵細(xì)菌, 按照細(xì)菌和裂解液為18的比例加入裂解(20 mmol/L Tris pH10, 3 mL/L巰基乙醇, 6 mol/L鹽酸胍), 不停攪拌, 室溫過夜。8000 r/min離心30 min, 收集上清; 然后用超聲波發(fā)生器以1

6、500W的功率超聲, 超聲9 s間歇15 s, 一個(gè)循環(huán)超聲90次, 攻擊超聲5個(gè)循環(huán), 待用。1.2.2 親和層析純化QKI7 金屬鰲合柱經(jīng)過A液(20mmol/L TrisHCl pH80, 150 mmol/L NaCl, 6 mol/L脲)平衡后, 取第一步準(zhǔn)備的上清直接采用金屬鰲合柱層析。上樣流速為8 mL/min; 上樣完成后用A液流洗至基線, 直接用B液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 150 mmol/L NaCl, 6 mol/L脲, 200 mmol/L咪唑)洗脫, 收集目的蛋白峰, 準(zhǔn)備下一步反相層析純化。1.2.3 反相層析純化QKI7 以8 mL/mi

7、n的流速用B液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 1 mL/L巰基乙醇, 5 mol/L脲, 500 mL/L異丙醇)流洗30 mL, 然后用A液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 1 mL/L巰基乙醇, 5 mol/L脲)平衡層析柱至基線, 調(diào)整紫外吸收至零點(diǎn)。用8 mL/min的流速上樣, 上樣結(jié)束后用A液流洗至基線, 采用20% B液流洗2個(gè)柱體積, 收集蛋白峰, 記為peak1, 再用75% B液洗脫2個(gè)柱體積, 收集蛋白峰, 記為peak2, 最后用100% B液洗脫2個(gè)柱體積, 收集蛋白峰, 記為peak3。電泳鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于peak2中。收集p

8、eak2, 準(zhǔn)備陰離子柱純化。1.2.4 強(qiáng)陰離子層析純化QKI7 以8mL/min的流速用B液(20mmol/L TrisHCl pH80, 1mL/L巰基乙醇, 5mol/L脲, 1 mol/L NaCl)流洗30 mL, 然后用A液(20 mmol/L TrisHCl pH80, 1mL/L巰基乙醇, 5 mol/L脲)平衡層析柱至基線, 調(diào)整紫外吸收至零點(diǎn)。用8 mL/min的流速上樣, 上樣結(jié)束后用A液流洗至基線, 采用7% B液流洗2個(gè)柱體積, 收集蛋白峰, 記為peak1, 再用20% B液洗脫2個(gè)柱體積, 收集蛋白峰, 記為peak2, 最后用100% B液洗脫2個(gè)柱體積, 收

9、集蛋白峰, 記為peak3。電泳鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于peak2中, 純度在95%左右, 4保存?zhèn)溆谩?.2.5 抗原的Western blot檢測 將未誘導(dǎo)細(xì)菌的裂解產(chǎn)物和最終純化的目的蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE并轉(zhuǎn)膜后, 用100 g/L的脫脂奶粉（TBST）封閉2 h, 一抗為anti6×His mAb(11000稀釋), 二抗為羊抗鼠HRPIgG（1500稀釋）, 依次加DAB和H2O2顯色。1.2.6 抗體的制備 將6只新西蘭大白兔隨機(jī)分成3組, 用純化的6×His 融合蛋白分別以弗氏佐劑、 聚丙烯酰胺凝膠、 NC膜作為佐劑常規(guī)免疫, 每次免疫PET32b(+)QK

10、I7融合蛋白200 g。首次免疫后1月進(jìn)行第2次免疫, 其后間隔2周進(jìn)行第3次免疫, 共3次。其中弗氏佐劑組第1, 第2次免疫分別用完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑及200 g抗原等體積混合, 于腋下和腹股溝區(qū)注射, 第3次免疫用200 g純抗原于耳緣靜脈直接注射。聚丙烯酰胺凝膠和NC膜組3次免疫均為腋下和腹股溝區(qū)注射。3組最后1 次免疫2周后, 從兔耳靜脈采血1 mL, 以間接ELISA 法檢測血清抗體效價(jià), 其中弗氏佐劑組抗體效價(jià)高于1105, 聚丙烯酰胺凝膠組和NC膜組抗體效價(jià)低于1102, 頸動脈插管分別收集血清。血清在4 孵育過夜, 離心收集上清, 分裝凍存于-70以備用。1.2.7 3

11、種不同的免疫策略抗體特異性的鑒定 用過表達(dá)QKI7的HepG2細(xì)胞蛋白提取進(jìn)行SDSPAGE 后, 電轉(zhuǎn)移至NC膜上, 以100 g/L脫脂奶粉封閉過夜, 用3組抗QKI血清(1700稀釋)進(jìn)行Western blot分析。1.2.8 所獲得抗體對內(nèi)源性抗原的檢測 用Hy906細(xì)胞蛋白提取物進(jìn)行SDSPAGE 后, 電轉(zhuǎn)移至NC膜上, 以100 g/L脫脂奶粉封閉過夜, 用弗氏佐劑組抗QKI血清(11000稀釋)進(jìn)行Western blot檢測。2 結(jié)果2.1 6×His融合蛋白的表達(dá)與純化抗原的鑒定 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后, 在PET32b(+)QKI7轉(zhuǎn)化菌裂解液中, 新出現(xiàn)1條Mr

12、約40000的蛋白帶(圖1), 與預(yù)期的6×HisQKI7融合蛋白Mr相符。經(jīng)金屬鰲合柱（圖2）, 反相層析柱（source 30RPC）（圖3）, 強(qiáng)陰離子柱（source 30Q）（圖1）層析法純化的上述蛋白, 在SDSPAGE后幾乎為單一條帶, 純度達(dá)到95%以上。圖1 6×HisQKI7融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化（略）1: 未用IPTG誘導(dǎo); 2: IPTG誘導(dǎo)4 h; 3: 純化的6×HisQKI7.圖2 6×HisQKI7融合蛋白經(jīng)金屬鰲合柱后純化結(jié)果（略）1: 金屬鰲合柱層析產(chǎn)物; M: 蛋白marker.圖3 6×HisQKI7融

13、合蛋白經(jīng)反相層析柱純化結(jié)果（略）1: 反向?qū)游鲋鶎游鑫? M: 蛋白marker.2.2 抗原的鑒定 將未誘導(dǎo)細(xì)菌的裂解產(chǎn)物和最終純化的目的蛋白產(chǎn)物作Western blot進(jìn)行鑒定（圖4）, 未誘導(dǎo)細(xì)菌的裂解產(chǎn)物可以看到1 條很弱的反應(yīng)帶, 最終純化的目的蛋白產(chǎn)物可以分別看到明顯的蛋白帶反應(yīng)。證明所純化的蛋白是我們所要的帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。圖4 抗His抗體對純化后抗原的Western blot分析（略）1: 未誘導(dǎo)細(xì)菌的裂解產(chǎn)物; 2: 純化的6×HisQKI7融合蛋白fusion protein(12 g); 3: 純化的6×HisQKI7融合蛋白(2 g).

14、2.3 3種不同的免疫策略抗體特異性的鑒定 在Western blot中, 3種不同的免疫策略組中只有弗氏佐劑組所產(chǎn)生的抗QKI多克隆抗體（1700稀釋）與在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)的QKI5蛋白起反應(yīng), 而聚丙烯酰胺凝膠和NC膜組不與過表達(dá)QKI5蛋白的HepG2細(xì)胞裂解產(chǎn)物反應(yīng)(圖5) 。該組抗體能與HepG2細(xì)胞蛋白提取物中1 條Mr約40000的蛋白帶反應(yīng), 與QKI5的Mr相符。2.4 所獲得抗體對內(nèi)源性抗原的檢測 用弗氏佐劑組所產(chǎn)生的抗QKI多克隆抗體（11000稀釋）對Hy906細(xì)胞的蛋白提取物做Western blot, 該組抗體能與Hy906細(xì)胞蛋白提取物中1條Mr約40000

15、的蛋白帶反應(yīng), 與QKI5的Mr相符（圖6）。說明我們所獲得的QKI多克隆抗體能檢測內(nèi)源性抗原的表達(dá)。圖5 抗QKI多克隆抗體的Western blot 鑒定（略）1, 2: 聚丙烯酰胺凝膠組多克隆抗體; 3, 4: NC膜組多克隆抗體; 5, 6: 弗氏佐劑組多克隆抗體.圖6 抗QKI多克隆抗體對內(nèi)源性抗原的Western blot鑒定（略）1, 2: 抗內(nèi)源性QKI5蛋白; 3: 蛋白 marker. 3 討論QKI不同的剪接體之間有90%以上的氨基酸同源序列, 有幾乎相同的抗原表位, 因此利用6×HisQKI7融合蛋白所制備的多克隆抗體可以識別QKI不同的剪接體, 其實(shí)是針對各

16、種QKI蛋白的多克隆抗體6。為了進(jìn)一步研究QKI的功能, 我們表達(dá)、 純化了6×HisQKI7融合蛋白, 并制備了高效價(jià)、 高特異性的抗QKI的多克隆抗體, 為從蛋白水平對QKI進(jìn)行研究提供了有力的工具7。實(shí)驗(yàn)中6×HisQKI 融合蛋白的His標(biāo)簽與Ni金屬離子鰲合柱的親和力很低, 以致于經(jīng)過一次親和層析后所收集的目的蛋白峰中還是含有很高比例的雜蛋白。我們又根據(jù)QKI7蛋白的氨基酸序列和蛋白質(zhì)疏水性, 等電點(diǎn)等性質(zhì)設(shè)計(jì)純化方案, 利用常用的反相柱層析和強(qiáng)陰離子柱層析才達(dá)到目的蛋白在95%比例以上的純化效果。分析原因可能是QKI蛋白的氨基酸序列和空間構(gòu)象影響了His標(biāo)簽與N

17、i金屬離子鰲合柱的親和力, 所以一步純化很難達(dá)到預(yù)期的效果。此外, 我們用所獲得的抗血清作過表達(dá)QKI5蛋白Western blot檢測, 雖然可以與目的蛋白起反應(yīng), 但是目的條帶的上下可以看到一些相對較弱的非特異條帶。分析原因可能有以下兩點(diǎn): (1)多克隆抗體針對的是多個(gè)抗原表位并且免疫用的抗原純度并未達(dá)到100%, 所以與細(xì)胞裂解液中的其他蛋白成分發(fā)生反應(yīng)屬于正?，F(xiàn)象?？梢詫Λ@得的多克隆抗血清進(jìn)行純化以獲得更高特異性的抗體。(2)可以調(diào)整Western blot中抗體的稀釋度, 進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件, 使非特異帶降低。最終利用我們所制備的抗體成功的檢測出在Hy906細(xì)胞中表達(dá)的QKI5, 說明所制備