黃淮海地區(qū)夏玉米紋枯病菌的融合群鑒定

1、黃淮海地區(qū)夏玉米紋枯病菌的融合群鑒定夏海波 伍恩宇 于金鳳*山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系 泰安 271018 基金項(xiàng)目：山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家獎(jiǎng)勵(lì)基金項(xiàng)目（No. 2004BS016）；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（No. hyhyzx07-049）*Corresponding author. E-mail: jfyu收稿日期：2007-11-12，接受日期：2008-01-11摘 要：從黃淮海地區(qū)采集玉米紋枯病標(biāo)樣250余份，分離得到176個(gè)絲核菌菌株。融合群測(cè)定及5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析結(jié)果表明，這些菌株分別屬于多核絲核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG4-HG-I、AG-5、WAG-Z融

2、合群及雙核絲核菌的AG-A、AG-Ba融合群。其中AG1-IA是優(yōu)勢(shì)融合群，占分離菌株總數(shù)的64.20%，其次是AG-Ba，占12.50%，再依次分別是WAG-Z（10.23%）、AGI-IB（5.11%）、AG-4-HG-I（3.98%）、AG-5（2.27%）和AG-A（1.70%）。其中AG-Ba融合群是國(guó)內(nèi)首次在玉米上分離得到。從各融合群中選取代表性的菌株進(jìn)行5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析結(jié)果表明，隸屬不同融合群或亞群的菌株其5.8S rDNA-ITS區(qū)序列存在較大的差異，而相同融合群（或亞群）不同菌株之間其序列的一致性可高達(dá)97%-100%。關(guān)鍵詞：立枯絲核菌，融合群，5.8S

3、 rDNA-ITS區(qū)序列分析The anastomosis groups of the corn sheath blight pathogen Rhizoctonia spp. in Huanghuai Plain and Haihe Plain of ChinaXIA Hai-Bo WU En-Yu YU Jin-Feng*Department of Plant Pathology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, ChinaAbstract: One hundred and seventy-six isolates were

4、obtained from corn sheath blight samples in Huanghuai Plain and Haihe Plain (including Shandong, Henan, Hebei Provinces and Northern regions of Jiangsu Province) of China. Anastomosis group identification and 5.8S rDNA-internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis showed that the isolates belo

5、nged to multinucleate Rhizoctonia AG1-IA, AG1-IB, AG4-HG-I, AG-5 and WAG-Z and binucleate Rhizoctonia AG-A and AG-Ba. Of these, AG-1-IA was the major anastomosis group(AG)（64.20% of total isolates), followed by AG-Ba (12.50%), WAG-Z (10.23%), AG1-IB (5.11%), AG4-HG-I (3.98%), AG-5 (2.27%) and AG-A (

6、1.70%). AG-Ba was isolated for the first time from maize in China. 5.8S rDNA-ITS sequence analysis showed that the isolates could be distinctly separated based on their AG types. The isolates belonging to the same AG (or sub-AG) showed 97%-100% sequence identity.Key words: Rhizoctonia solani, anasto

7、mosis group, 5.8S rDNA-ITS sequence隨著緊湊型玉米品種的大面積種植，玉米栽培密度提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米紋枯病發(fā)生的小氣候條件。自80年代以來，該病在一些地區(qū)為害日益嚴(yán)重，成為玉米上的一種重要病害(梁繼農(nóng)等 1997；唐朝榮等 2000)。我國(guó)不同玉米種植區(qū)引起玉米紋枯病的絲核菌的融合群不同（高衛(wèi)東 1987；唐朝榮等 2000；李華榮和蘭景華 1997；肖炎農(nóng)等 2002）。但引起典型癥狀的主要是立枯絲核菌Rhizoctonia solani AG1-IA群。黃淮海地區(qū)是我國(guó)夏玉米主產(chǎn)區(qū)，玉米紋枯病對(duì)該地區(qū)玉米的危害呈逐年加重的趨勢(shì)，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)人

8、對(duì)該地區(qū)玉米紋枯病菌的融合群類群進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究旨在利用融合群鑒定手段和5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析方法確定黃淮海地區(qū)夏玉米紋枯病菌的融合群類群，為有效控制玉米紋枯病的危害，特別是為抗病品種的選育提供基礎(chǔ)資料。1 材料與方法1.1 供試菌株的采集和鑒定2004-2007年，從山東、河南、河北三省及江蘇北部地區(qū)夏玉米產(chǎn)區(qū)采集玉米紋枯病罹病葉鞘、苞葉、菌核，采用常規(guī)組織分離法分離菌株。分離、純化后獲得的純培養(yǎng)物分別保存在4的PDA試管斜面上，備用。1.2 菌絲融合群測(cè)定菌絲融合群測(cè)定所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株（屬于日本系統(tǒng)）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)唐文華教授和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊根華教授提供。融合群測(cè)定是采用玻片

9、對(duì)峙法，按Zhang & Dernoeden (1995)的方法進(jìn)行。融合群鑒定采用Sneh（1991）的融合標(biāo)準(zhǔn)：1、完全融合：接觸細(xì)胞的細(xì)胞壁溶解，細(xì)胞質(zhì)融合，互有引誘現(xiàn)象。2、不完全融合：接觸細(xì)胞間細(xì)胞壁溶解，某一細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)流入另一細(xì)胞內(nèi)，且造成雙方融合及其鄰近幾個(gè)細(xì)胞發(fā)生畸形，原生質(zhì)減少或消失，有殺死反應(yīng)，一方引誘另一方。3、接觸融合：接觸細(xì)胞壁不溶解，接觸的兩細(xì)胞無(wú)異常反應(yīng)，各自菌絲按原來方向繼續(xù)生長(zhǎng)，屬于前兩種情況的菌絲融合方式視為相同融合群。1.3 供試菌株DNA的提取從融合群鑒定確定是隸屬7個(gè)不同融合群的菌株中分別隨機(jī)選取1-3個(gè)菌株，共計(jì)11個(gè)菌株（見表1）作為各融

10、合群的代表菌株。各菌株在PDA平板上活化3天后，切取4mm小塊轉(zhuǎn)移至PD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（25、80r/min）7d。7d后將菌絲過濾烘干，采用盧圣棟（1999）的方法提取各供試菌株的全基因組DNA。1.4 PCR擴(kuò)增和 5.8S rDNA-ITS區(qū)序列測(cè)定選用50L反應(yīng)體系，各組成成分如下：32.5L雙蒸水；5.0L 10×PCR緩沖液；4.0L MgCl2 (25mol/L)；4.0L dNTP (dATP, dCTP, dGTP和dTTP各2.5mol/L)；引物ITS1和ITS4（濃度為25mol/L）各1L；模板DNA 2.0L；Taq酶（5U）0.5L。擴(kuò)增反應(yīng)共3

11、0個(gè)循環(huán)，條件為94變性1min，60退火1min，72延伸 2min。擴(kuò)增結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，TBE為電泳緩沖液，上樣5L。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后由北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。以ITS1和ITS4作為測(cè)序引物，進(jìn)行正反方向的雙向測(cè)序。每一序列用DNACLUB軟件對(duì)正向（5¢-3¢）和反向(3¢-5¢)序列進(jìn)行核對(duì)并生成5¢-3¢的完整序列。用Bioedit軟件進(jìn)行多重序列比較，MEGA3.1軟件構(gòu)建供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。表1 11個(gè)測(cè)序菌株的來源及其融合群歸屬Table 1 Locality and anastomo

12、sis group of the eleven isolates used for sequencing菌株Isolates來源Source核數(shù)Nucleus number融合群Anastomosis groupYWK-3山東泰安 Taian, Shandong多核 multinucleateAG1-IAYWK-31山東泰安 Taian, Shandong雙核 binucleateAG-BaYWK-42山東泰安 Taian, Shandong雙核 binucleateAG-BaYWK-63山東蓬萊 Penglai, Shandong多核 multinucleateWAG-ZYWK-72河北保定

13、 Baoding, Hebei多核 multinucleate AG1-IBYWK-83河北滄州 Cangzhou, Hebei雙核 binucleateAG-AYWK-85河北滄州 Cangzhou, Hebei雙核 binucleateAG-AYWK-92山東泰安 Taian, Shandong多核 multinucleateAG4-HG-IYWK-112河南西華 Xihua, Henan雙核 binucleateAG-BaYWK-120河南臨潁 Linying, Henan多核 multinucleateAG1-IAYWK-130河南安平 Anping, Henan多核 multinuc

14、leateAG-52 結(jié)果與分析2.1 黃淮海地區(qū)夏玉米紋枯病菌的融合群組成和分布采自山東、河南、河北三省及江蘇北部地區(qū)的250多份玉米紋枯病標(biāo)本中共分離、純化獲得176個(gè)絲核菌菌株（表2）。融合測(cè)定結(jié)果表明，176個(gè)絲核菌菌株可劃分為7個(gè)融合群，113個(gè)菌株屬于AG1-IA融合群，其中11.5%的菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株間為完全融合（見圖1），另外88.5%的菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株間為不完全融合（見圖2）。9個(gè)屬于AG1-IB融合群的菌株中有88.9%為不完全融合。7個(gè)屬于AG4-HG-I融合群的菌株中有85.7%為不完全融合。4個(gè)屬于AG-5融合群的菌株均為不完全融合。18個(gè)屬于WAG-Z融合群的菌株中有8

15、3.3%為不完全融合。3個(gè)屬于AG-A融合群的菌株中有66.7%為不完全融合。22個(gè)屬于AG-Ba融合群的菌株中有90.9%為不完全融合。由表3可以看出，黃淮海夏玉米紋枯病菌是由多核絲核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG4-HG-I、AG-5、WAG-Z融合群及雙核絲核菌的AG-A、AG-Ba融合群構(gòu)成，其中AG1-IA群出現(xiàn)頻率最高，占全部菌株的64.20%，為優(yōu)勢(shì)融合群。其次是AG-Ba，占12.50%。由表3還可以看出，AG1-IA為四省份玉米紋枯病的優(yōu)勢(shì)致病群，而其他融合群的分布在不同地區(qū)間存在一定的差異。如AG-Ba融合群在河南省獲得的菌株數(shù)量較多，在山東及河北的數(shù)量相對(duì)較少，而在

16、江蘇北部地區(qū)沒有分離到。因此AG-Ba融合群的分布及致病力問題有待于進(jìn)一步研究。表2 菌株的來源及數(shù)量Table 2 Locality and number of all isolates來源Source 數(shù)量Number來源Source數(shù)量Number山東泰安 Taian, Shandong8河北景縣 Jingxian, Hebei1山東濰坊 Weifang, Shandong5河北邯鄲 Handan, Hebei3山東文登 Wendeng, Shandong5河南民權(quán) Minquan, Henan8山東蓬萊 Penglai, Shandong3河南西華 Xihua, Henan5山東海陽(yáng)

17、Haiyang, Shandong3河南淮陽(yáng) Huaiyang, Henan4山東博興 Boxing, Shandong 3河南臨潁 Linying, Henan6山東曹縣 Caoxian, Shandong5河南安平 Anping, Henan3山東滕州 Tengzhou, Shandong4河南登封 Dengfeng, Henan4山東棗莊 Zaozhuang, Shandong5河南溫縣 Wenxian, Henan3山東曲阜 Qufu, Shandong3河南許昌 Xuchang, Henan3山東德州 Dezhou, Shandong4河南商丘 Shangqiu, Henan3山東禹

18、城 Yucheng, Shandong5河南禹州 Yuzhou, Henan3山東肥城 Feicheng, Shandong3江蘇東海 Donghai, Jiangsu3山東聊城 Liaocheng, Shandong5江蘇邳州 Pizhou, Jiangsu3山東煙臺(tái) Yantai, Shandong5江蘇泗陽(yáng) Siyang, Jiangsu5河北衡水 Hengshui, Hebei1江蘇五港 Wugang, Jiangsu1河北保定 Baoding, Hebei9江蘇徐州 Xuzhou, Jiangsu7河北石家莊Shijiazhuang, Hebei6江蘇漣水 Lianshui, Jia

19、ngsu2河北滄州 Cangzhou, Hebei3江蘇灌云 Guanyun, Jiangsu4河北廊坊 Langfang, Hebei2江蘇連云港 Lianyungang, Jiangsu2天津 Tianjin2江蘇灌南 Guannan, Jiangsu3河北河間 Hejian, Hebei2江蘇睢寧 Suining, Jiangsu3河北邢臺(tái)Xingtai, Hebei2江蘇淮安 Huaian, Jiangsu2河北阜城 Fucheng, Hebei2縱觀四省玉米紋枯病菌的融合群分布可以看出，來自山東的玉米紋枯病菌，其融合群的類型最多，可分為6個(gè)類型，在已鑒定的7個(gè)類型中，只有AG-A融合

20、群的菌株沒有分離到。其次是來自河北的玉米紋枯病菌，被分為5個(gè)類型，在鑒定的7個(gè)類型中，AG4-HG-I 及AG-5融合群的菌株沒有被分離到。來自河南及江蘇的玉米紋枯病菌均被分為3個(gè)類型，除AG1-IA是它們共同擁有的融合群外，其他兩個(gè)融合群也各不相同。說明引起玉米紋枯病的病原菌其融合群的類型與地理位置存在一定的關(guān)系，但AG1-IA融合群在各地均是優(yōu)勢(shì)致病群。 圖1 YWK-96與標(biāo)準(zhǔn)菌株AG1-IA完全融合 圖2 YWK-186與標(biāo)準(zhǔn)菌株AG1-IA不完全融合Fig. 1 Perfect fusion between YWK-96 and AG1-IA. Fig. 2 Imperfect fu

21、sion between YWK-186 and AG1-IA.表3 黃淮海夏玉米紋枯病絲核菌融合群的構(gòu)成和分布Table 3 Distribution and constitution of Rhizoctonia spp. from corn sheath blight in Huanghuai Plain and Haihe Plain融合群Anastomosis group出現(xiàn)頻率%Frequency分布Distribution總計(jì)Total山東Shandong河南Henan河北Hebei江蘇北部地區(qū)Northern regions of JiangsuAG1-IA64.2050241

22、623113AG1-IB5.1120709AG4-HG-I3.9860017AG-52.2722004AG-A1.7000303AG-Ba12.503163022WAG-Z10.233041118總計(jì) Total100.00664233351762.2 供試菌株5.8S rDNA-ITS序列分析從隸屬不同融合群的菌株中隨機(jī)選取11個(gè)菌株（表1）作為玉米紋枯病菌7個(gè)不同融合群的代表菌株，測(cè)定其5.8S rDNA-ITS區(qū)序列。將測(cè)得的11個(gè)菌株的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，得到與這些菌株親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株序列，進(jìn)一步明確了這些菌株的分類地位。利用Bio

23、edit軟件對(duì)供試菌株及標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的序列進(jìn)行多重序列比較，利用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。其中DQ307250(AG1-IA)、AB122138（AG1-IB）、AB000031（AG4-HG-I）、DQ355140（AG-5）、DQ102413（AG-A）、AB286931（AG-Ba）和AF222799（WAG-Z）的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列來源于GenBank，代表7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的序列。圖3 11個(gè)供試菌株依據(jù)ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by analysis of 5.8S rDNA i

24、nternal transcribed spacer nucleotide sequences from eleven isolates of Rhizoctonia spp.由圖3可以看出，YWK-92與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株AG4-HG-I的一致性為100%，YWK-72與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株AG1-IB的一致性為99%，YWK-3和YWK-120與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株AG1-IA一致性為100%，YWK-130與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株AG-5的一致性為100%，YWK-31、YWK-42、YWK-112與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株AG-Ba的一致性為97%-100%，YWK-83和YWK-85與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株AG-A的一致性為99%，YW

25、K-63與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株WAG-Z的一致性為99%，而不同融合群之間的一致性僅為64%-91%。2.3 黃淮海夏玉米紋枯病菌不同融合群菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析 由圖3可以看出，依據(jù)各融合群代表菌株5.8S rDNA-ITS區(qū)序列的一致性，代表7個(gè)不同融合群的菌株可以明顯分為三組，第一組主要包括多核絲核菌立枯絲核菌的成員即AG1-IA融合群的代表菌株YWK-3和YWK-120，AG1-IB的代表菌株YWK-72，AG4-HG-I融合群的代表菌株YWK-92及AG-5融合群的代表菌株YWK-130，此4個(gè)融合群菌株其5.8S rDNA ITS區(qū)序列的一致性為88%-91%；第二組是雙核絲核菌的成員，分

26、別是AG-Ba融合群的代表菌株YWK-31、YWK-42、YWK-112和AG-A融合群的代表菌株YWK-85和YWK-83，此兩個(gè)融合群的代表菌株的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列的一致性為88%；第三組僅包括多核絲核菌WAG-Z融合群的代表菌株YWK-63。根據(jù)5.8S rDNA-ITS區(qū)序列的一致性還可以看出，第一組和第二組不同融合群的代表菌株其一致性為84%，而WAG-Z融合群的菌株與此兩組菌株序列的一致性僅為64%，說明多核絲核菌WAG-Z融合群的代表菌株與同為多核絲核菌的立枯絲核菌不同融合群菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。3 討論玉米紋枯病的病原種類構(gòu)成，由于樣本來源或發(fā)生地的不同，存在

27、著一定的差異。菲律賓報(bào)道只發(fā)現(xiàn)AG1-IA（Pascual et al. 2000）。Demirci & Kordali（1999）從土耳其黑海沿岸地區(qū)的玉米病穗上分離到AG-4，AG-5，AG-10，AG-Ba和WAG-Z。我國(guó)不同玉米種植區(qū)玉米紋枯病菌的融合群也不相同。高衛(wèi)東（1987）報(bào)道在華北地區(qū)從玉米罹病葉鞘中分離出AG1-IA、AG1-IB、AG-3、AG-5、CAG-3、CAG-6、CAG-8、CAG-9和CAG-10等多個(gè)融合群，其中AG1-IA是主要融合群。四川玉米紋枯病的主要病原有AG1-IA、AG-4及WAG-Z（李華榮和蘭景華 1997）。江蘇省引起玉米紋枯病的

28、病原有AG1-IA 和AG1-IC融合群（陳厚德等 1996）。肖炎農(nóng)等（2002）自湖北省9個(gè)主要玉米產(chǎn)區(qū)采集玉米紋枯病標(biāo)樣，分離得到55個(gè)絲核菌菌株，融合群測(cè)定表明，這些菌株分別屬于立枯絲核菌的AG1-IA、AG-4、AG-5及雙核絲核菌的AG-A、AG-B(O)、AG-E和多核絲核菌的WAG-Z等7個(gè)融合群，其中AG1-IA是優(yōu)勢(shì)融合群。綜合各地區(qū)的研究結(jié)果可以看出，在我國(guó)，引起玉米紋枯病的優(yōu)勢(shì)致病群是立枯絲核菌 Rhizoctonia solani AG1-IA群。本研究以黃淮海地區(qū)玉米紋枯病菌為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在黃淮海地區(qū)夏玉米上引起玉米紋枯病的病原有AG1-IA、AG1-IB、AG4

29、-HG-I、AG-5、AG-A、AG-Ba和WAG-Z融合群的絲核菌，此結(jié)果與肖炎農(nóng)等（2002）對(duì)湖北玉米紋枯病菌的鑒定結(jié)果類似。唯一不同的是在黃淮海地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)AG-B(O)融合群的菌株，而是新發(fā)現(xiàn)了AG-Ba融合群的菌株，此類群是國(guó)內(nèi)首次在玉米上分離到。另外5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析結(jié)果進(jìn)一步確定了供試菌株融合群鑒定結(jié)果的可靠性。雙核絲核菌AG-Ba融合群最初是作為粟灰疫病病原被報(bào)道的。Nakata和Kawamura發(fā)現(xiàn)此病原在日本能夠引起水稻灰色菌核?。⊿neh et al. 1991）。Ogoshi等（1983）依據(jù)菌絲融合群分類法把該病原劃分為雙核絲核菌的AG-Ba融合群

30、。Demirci & Kordali（1999）從士耳其黑海沿岸地區(qū)的玉米病穗上分離得到12個(gè)AG-Ba融合群的菌株，占其分離菌株總數(shù)的30%。我國(guó)岳紅賓等（1997）從河南玉米地和菜地土壤中分離得到14個(gè)絲核菌菌株，經(jīng)融合鑒定表明14個(gè)菌株中有5個(gè)菌株屬于AG-Ba融合群，但沒有經(jīng)5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析進(jìn)一步確定。本研究在玉米紋枯病罹病組織上分離得到AG-Ba融合群，并利用5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析方法確定了融合群鑒定的可靠性。AG-Ba融合群能引起玉米紋枯病在國(guó)內(nèi)尚屬首例報(bào)道。REFERENCESChen HD, Liang JN, Zhu H, Zhao

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