2019年食品過敏原的檢測(cè)與分析

1、食品過敏原的檢測(cè)與分析雙擊自動(dòng)滾屏?xí)r間：2010-4-26來源：熱帶醫(yī)學(xué)雜志作者:瀏覽：159次【字體：大中小】食品過敏現(xiàn)已成為一個(gè)新興的公眾性健康問題， 特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家， 調(diào)查顯示全世界范圍內(nèi)有1%2%的成年人對(duì)食品過敏，而低于三歲的兒童中有8%以上對(duì)食品過敏。產(chǎn)生的臨床癥狀包括皮膚反應(yīng)（蕁麻疹、血管性水腫、 濕疹），呼吸癥狀（哮喘、鼻炎），腸胃癥狀（嘔吐、腹瀉、腸胃痙攣），系統(tǒng) 反應(yīng)（心血管癥狀包括過敏性休克）等。在過去的幾十年中，食品過敏的發(fā)病率 和流行情況日益增加，給臨床變態(tài)反應(yīng)學(xué)和食品工業(yè)造成了巨大的壓力。力卩上現(xiàn)在人們生活習(xí)慣的改變，飲食面的快速拓寬，特別是轉(zhuǎn)基因食品的大量涌現(xiàn)，

2、過敏癥狀亦趨于多樣化、復(fù)雜化和嚴(yán)重化。因此，對(duì)食品過敏原的檢測(cè)與分析就是 一個(gè)極其重要的問題。一般來說，食品過敏原為分子量介于1000070000之間的蛋白或糖 蛋白，占食品總蛋白的極小一部分，分別屬于不同的蛋白家族。但是微量的食品 過敏原蛋白即可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。系統(tǒng)全面、精確可靠的食品過敏原檢測(cè)和 分析技術(shù)體系正在形成，本文對(duì)這一研究領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的綜述性 分 析。1 .利用人血清特異性lg E檢測(cè)食品過敏原過敏原與lg E結(jié)合是過敏原體現(xiàn)其生物活性的中心環(huán)節(jié)，因此食品 過敏原檢測(cè)過程中特異性lg E的血清學(xué)檢測(cè)必不可少。對(duì)于能夠引起5 0%病 人產(chǎn)生過敏反應(yīng)的主要食品 過敏原

3、必須測(cè)定特異性lg E與食品過敏原結(jié)合的能 力，包括引發(fā)過敏反應(yīng)的頻率，熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定性等。但是這種方法不能解 決食品過敏原的交叉致敏問題，因?yàn)樗怯脝蝹€(gè)過敏病人的血清進(jìn)行檢測(cè)的。1.1 RAST抑制實(shí)驗(yàn)和EAST抑制實(shí)驗(yàn)自從lg E成功純化及抗lg E抗體的制備后，放射 過敏原吸附實(shí)驗(yàn)（radio allergosorbenttest RAST得以設(shè)計(jì)應(yīng)用。之后改進(jìn)的酶標(biāo)記過敏原吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linkedallergosorbentassays,EAST）及熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)也均已建立。這些方法均是檢測(cè)特異性lg E與過敏原相互作用的免疫分析方法。特異性lg E抗體與

4、食品過敏原的結(jié)合在固相載體 表面進(jìn)行并被檢測(cè)，是體外食品過敏診斷的一種已標(biāo)準(zhǔn)化的方法，得到廣泛使用。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立了放射過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)（radio allergosorbenttest RAST抑制實(shí)驗(yàn)）和酶標(biāo)記過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)技術(shù) （enzyme linkedallergosorbentassays,EAST 抑制實(shí)驗(yàn)）。在體外過敏原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，這些方法是目前國(guó)際上變態(tài)反應(yīng)臨床及科研人 員使用最廣泛、最靈敏的方法，也是評(píng)價(jià)過敏原總致敏活性的關(guān)鍵技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn) 是全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫技術(shù)，避免人工實(shí)驗(yàn)操作帶來的誤差，保證了它的靈敏性和準(zhǔn)確性，同時(shí)解決了不同食品 過敏原的交叉致敏問題。因

5、此在國(guó)際上不同實(shí)驗(yàn) 室之間，RAST 抑制實(shí)驗(yàn)技術(shù)和統(tǒng)計(jì) 分析方法按統(tǒng)一的程序進(jìn)行，每年還有定期的全球質(zhì)量控制檢測(cè)以保證儀器正常運(yùn)行和結(jié)果可靠。目前， 在國(guó)外大醫(yī)院、主要過敏原生產(chǎn)企業(yè)基本都使用法瑪西亞公司UniCAP系統(tǒng)進(jìn)行RAST抑制實(shí)驗(yàn)。此外， RAST抑制實(shí)驗(yàn)還是 過敏原生產(chǎn)廠商比較每一批 過 敏原制劑和內(nèi)部參考品差異的主要方法。RAST和 EAST 抑制實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被用來檢測(cè)和|分析一系列食 品的致敏性，如生海鮮和比薩餅中的鱈魚 過敏原；含有花生的食品和花生油等相 關(guān)產(chǎn)品的致敏性；大豆相關(guān)食品的致敏性； 榛實(shí)過敏原的熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定 性研究；堅(jiān)果類食品的交叉致敏作用等。RAST 和 E

6、AST抑制實(shí)驗(yàn)的一個(gè)主要不足是對(duì)人血清的依 賴性，血清是很難保證一致的，因此這兩種方法也難以標(biāo)準(zhǔn)化。盡管它們可以很 好的檢測(cè)食品過敏原，但是人lg E抗體特異性的不確定性大大限制了這些方法 在更寬領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，商業(yè)化的食品 過敏原固相載體與lg E 的結(jié)合能力 也不盡相同。所有這些都限制了RAST和EAST抑制實(shí)驗(yàn)在食品 過敏原定量 檢測(cè)中的應(yīng)用?？傮w上來說，RAST和EAST抑制實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)各種形式的食 品過敏原蛋白（蛋白粗提物， 純化的過敏原樣品， 不同物種、食品中過敏 原）與lg E結(jié)合能力的較為理想的方法。1.2IEF-PAGE和SDSPAGE 免疫印跡實(shí)驗(yàn)通過等電聚焦（IEF）和S

7、DS PAGE 電泳（雙向電泳也包括在內(nèi)）結(jié)合免疫印跡分析可以進(jìn)行單個(gè)食品過敏原的分離。SDS PAGE 免疫印跡目前可以用于幾乎所有的食品 過敏原的分析。雙向電泳 常用于檢測(cè)分子量相近但等電點(diǎn)、 氨基酸序列不同的同源性蛋白分子。 與 RA ST 和 EAST類似，免疫印跡方法同樣可以通過lg E 抑制實(shí)驗(yàn)來消除不同來源的不同食品 過敏原之間的交叉反應(yīng)。2 用單克隆或多克隆抗體檢測(cè)食品過敏原為了克服用人血清lg E抗體檢測(cè)食品過敏原的不足，依賴于兔、鼠、 綿羊、山羊、雞等的動(dòng)物抗血清免疫 分析方法逐漸發(fā)展起來。這些|抗體檢測(cè)激發(fā) 免疫作用抗原的效果要比過敏原好。2.1 雙免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（ Ouc

8、hterlony）這是一種比較兩種或兩不種以上食品過敏原的定性檢測(cè)分析方法。將 抗體|和各種不同的樣品蛋白同時(shí)放進(jìn)孔中，令其相互向?qū)Ψ阶杂蓴U(kuò)散，在達(dá) 到平衡時(shí)會(huì)形成一條沉淀線雙免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)可以區(qū)分一致的、不一致的和部分一致的蛋白樣品。 MALMHEDEN YMAN 等利用雙免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 分析了意大利面 食和養(yǎng)麥?zhǔn)称分械柠滬煹鞍?。該方法的不足是不能進(jìn)行定量 分析，靈敏度較低， 而且比較費(fèi)時(shí)（2448h） o2.2 點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)最近報(bào)道了點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)在各種食品中檢測(cè)花生 過敏原中的應(yīng) 用。將樣品滴在預(yù)先用花生蛋白 抗體包埋的一張聚酯底物上，再用二抗進(jìn)行免疫檢測(cè)即可檢測(cè)到已經(jīng)結(jié)合的花生蛋白。

9、這種方法靈敏度很高而且使用成本較 低。2.3 火箭免疫電泳實(shí)驗(yàn)（RIE）該分析方法是通過含有 抗體|的凝膠進(jìn)行檢測(cè)分析的。樣品中的蛋白 根據(jù)各自的電泳移動(dòng)速率進(jìn)行移動(dòng)，直到按照抗體 /抗原的比例常數(shù)在凝膠上形成“火箭”狀的沉淀?；鸺隣畛恋韰^(qū)的顏色的深淺與樣品中蛋白的豐度直接 相關(guān)。所形成的沉淀既可以用考馬斯亮藍(lán)染色也可以用免疫染色（后者的靈敏度更高）。RIE應(yīng)用于食品 過敏原檢測(cè)的報(bào)道較為少見 °MALMHEDEN YMAN 等用 RIE檢測(cè)了各種食品中雞蛋、牛奶、榛實(shí)和花生蛋白的存在，但是沒有指出數(shù)據(jù)的回收率和重現(xiàn)性。 RIE的不足就是實(shí)際操作過程中制膠和染色的操作復(fù)雜。2.4 酶

10、聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）ELISA 是種酶免疫方法，20世紀(jì)9 0年代末期ELISA技術(shù)發(fā)展迅速，加以全自動(dòng)酶標(biāo) 分析儀的應(yīng)用， 使ELISA 的特異性和靈敏度有了很大的提高，在食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用大大擴(kuò)展°ELISA的特點(diǎn)是抗原或抗體的固相化和酶標(biāo)記，在目前最常用 的 ELISA 中，抗體|要結(jié)合在固相載體的表面與樣品蛋白（抗|原）自 由反應(yīng)?？贵wI和抗原|反應(yīng)后用另外一種用酶標(biāo)記的抗體（二抗）來檢測(cè)已經(jīng)反 應(yīng)結(jié)合在固相載體表面的樣品蛋白（抗原）。結(jié)合在固相載體表面的 抗體一定 時(shí)， 與之結(jié)合的樣品蛋白（抗 原）越多，酶標(biāo)記的|抗體的顏色反應(yīng)就越強(qiáng)，同 時(shí)血清抗體的濃度越高，E

11、LISA顯色也越強(qiáng)。為了能夠檢測(cè)痕量的食品 過敏 原ELISA中使用了生物素標(biāo)記的二抗和含有過氧化物酶的鏈霉親和素Page在食品安全方面ELISA 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、疫情、有害微生物、動(dòng)植物毒素等的快速檢測(cè) 分析， 并取得了較好的效現(xiàn)在發(fā)展了很多果。隨著人們對(duì)食品過敏認(rèn)識(shí)的深入和重視程度的加強(qiáng), 種 ELISA 方法用于食品過敏原總蛋白提取物和特殊食品 過敏原的檢測(cè)和定量分析。ELISA 已經(jīng)成為一種系列化、微量化、商品化的食品安全快 速檢測(cè)方法，是目前應(yīng)用最廣泛的生物檢測(cè)技術(shù)之一。3 PCR 分析食品過敏原檢測(cè)的一個(gè)新靶標(biāo)就是特殊食品蛋白的cDNAoDNA分子可以通過PCR

12、技術(shù)擴(kuò)增，在PCR過程中DNA分子的引物也得到了擴(kuò) 增。產(chǎn)物即可利用分子量的大小在瓊脂糖電泳上進(jìn)行分離。一般來說通過引物的選擇可以使具有一定同源性的DNA分子之間的交叉反應(yīng)降低到最低程度，盡 可能的避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。PCR擴(kuò)增技術(shù)一般用來對(duì)各種食品中經(jīng)基 因修飾的成份（如轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米）的檢測(cè)和定量分析。而直到現(xiàn)在， 只有兩種PCR方法專門針對(duì)食品 過敏原（榛實(shí)和小麥）的檢測(cè)（表1）。方法均具有很高的靈敏度，都可以達(dá)到0.0 01%。3.1 研究食品的 DNA 性質(zhì)（質(zhì)量）盡管麥片中麥膠蛋白的檢測(cè)限度低于0.2 mg/100 g,但是用小麥 PCR 系統(tǒng)分析燕麥糠制造的酸乳酪布丁樣

13、品 時(shí)只有二分之一的結(jié)果顯示陽性，麥膠蛋白含量大于lmg/100 g。因此，與小麥 PCR 檢測(cè) 方法的高靈敏度相比，對(duì)這些樣品用ELISA 檢測(cè)試劑盒更為合適。HOLZHAUSER 等11對(duì)烤榛實(shí)（ 14 0°C,30 min）中低豐度主要榛實(shí)過敏原 Cor a 1（ 0.001%） 的 DNA 進(jìn)行了擴(kuò)增（與巧克力和其他不同的食品中榛實(shí)蛋白的 含量一致）。而且不同的食品類型也大大影響了過敏原 DNA 的定量檢測(cè) 限度。也有人應(yīng)用 PCR 技術(shù)研究了食品處理過程相關(guān)參數(shù)對(duì)面包類食物中 轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測(cè)的影響13。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在研究的食品（面 包和蛋糕） 中含量低于0.5%

14、轉(zhuǎn)基因玉米的 DNA 是檢測(cè)不到的， 而經(jīng)過各個(gè)加工步驟 （包括 2 0 0 C烤 3 0 min） 后得到的白 面 包中 力卩 入的0. 3%轉(zhuǎn)基因大豆的 DNA 是可以檢測(cè)的。這就說明在用 PCR 技術(shù)檢測(cè)過敏原 DNA 時(shí)一定要考慮食品處理過程中過敏原 D NA 的降解。3.2 與 ELISA 的對(duì)比ELISA 可以檢測(cè)食品樣品中已知來源（包含過敏原）的蛋白， 而 PCR 可以在相關(guān)蛋白不存在的情況下檢測(cè)其DNA的存 在。因此， PCR 技術(shù)增加了食品中存在 過敏原假陽性測(cè)定結(jié)果的機(jī)率。PCR 方法的優(yōu)點(diǎn)是比較快，如果要研究已知序列的DNA, 這個(gè)分析過程只需要 710 do對(duì)于一個(gè)已經(jīng)

15、純化的 過敏原，E LISA 分析要用一個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間， 此外， 制備其特異性的抗體要再 加一個(gè)月。PCR 技術(shù)是以簡(jiǎn)單、確定的 DNA 序列為基礎(chǔ)的， 而 E LISA 分析卻要依賴于質(zhì)量穩(wěn)定的動(dòng)物 抗體o將來重組抗體將有助于抗血清 的標(biāo)準(zhǔn)化。加工食品中 DNA 和 蛋白 的穩(wěn)定性都是要 考慮的 重 要 因素?？傊?PCR 技術(shù)適合于復(fù)雜食品中 過敏原的定量分析，在這方面應(yīng) 該得到大力推廣。4 組胺釋放實(shí)驗(yàn)（HRT）組胺釋放實(shí)驗(yàn)（ histamine releasing t est， HRT）主要是通過食品過敏原激發(fā)致敏的靶細(xì)胞，引起細(xì)胞釋放組 胺，組胺含量可應(yīng)用熒光測(cè)定法、放射免疫法等

16、方法測(cè)定，與適宜參照進(jìn)行比較， 確定組胺釋放率陽性標(biāo)準(zhǔn)，從而進(jìn)行過敏原活性測(cè)定及鑒定的一類方法。通常用 抗IgE抗體|作陽性參照，以樣品介質(zhì)（如PBS ）為陰性參照，以排除實(shí)驗(yàn)過 程中組胺的非特異性釋放。此外，某些待測(cè)過敏原或提取物本身含有組胺，并且待檢過敏原或其共存物可能具有靶細(xì)胞毒性，引起組胺非特異釋放，因此, 必須設(shè)樣品對(duì)照及非致敏靶細(xì)胞對(duì)照。為了排除生物胺如尸胺、腐胺對(duì)熒光法測(cè) 定組胺的干擾， 有報(bào)道利用玻璃纖維包被的微量滴定板 (glass- f ibre coated microtiter plate) 來分離組胺 與干擾成分。肝素化洗滌血( heparinized washed

17、bl ood)不用進(jìn)一步分離便可測(cè)定，也可直接應(yīng)用全血或密度富積的 Bas進(jìn) 行測(cè)定。該改良方法只需2 5 ul全血，可實(shí)現(xiàn)微量化操作。NORGAARD 等將HRT用于雞蛋和牛奶 過敏原的檢測(cè) 和診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)該方法具有較好的靈敏度，結(jié)果的重現(xiàn)性很好，但是食品的狀態(tài)(是 否新鮮)對(duì)其影響較為顯著。在鱈魚過敏原的檢測(cè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與雙盲對(duì)照試驗(yàn)相 比HRT具有較高的特異性和較低的靈敏度，但新鮮鱈魚的過敏原提取物可以顯著增強(qiáng)HRT檢測(cè)的靈敏度。 此外，HRT還成功的用于花生、榛子過敏原的 檢測(cè)及致敏作用機(jī)理的研究。5 過敏原指紋圖譜快速檢測(cè)方法中藥指紋圖譜是在制定中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的過程中針對(duì)中藥中成分的復(fù) 雜

18、性以及缺乏用以鑒定成分所需的化學(xué)對(duì)照品這一癥結(jié)而產(chǎn)生的一種方法，是在中藥化學(xué)成分色譜指紋圖譜的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。指紋圖譜最早的概念來源 于 19 世紀(jì)末 2 0 世紀(jì)初的犯罪學(xué)和法醫(yī)學(xué)，是最新科技成果與最古老的醫(yī)學(xué)科學(xué)傳統(tǒng)相結(jié)合的結(jié)果。作為一種綜合的、宏觀的和可量化的鑒別手段，中藥指紋圖譜在研究方法上具有整體性、模糊性和可以量化的特點(diǎn)，其在中醫(yī)藥界的應(yīng)用受到全世界范圍內(nèi)的認(rèn)可。鑒于指紋圖譜的實(shí)用性和科學(xué)性，食品與中藥諸多方面的相似性，吳海強(qiáng)等首次提出將指紋圖譜的 原理和技術(shù)應(yīng)用到食品安全相關(guān)的研究中去，特 別是應(yīng)用到食品過敏原的快速檢測(cè)、分析上來。以常見過敏食品為研究對(duì)象，提 取其過敏原總蛋白，初步研究了食品過敏原總蛋白2DE指紋圖譜在食品 過敏 原快速檢測(cè)中應(yīng)用的可行性，肯定了該方法在不同檢測(cè)儀器和試驗(yàn)耗材之間良好 的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了以2