纖維素酶的研究及應用-酶工程論文

1、纖維素酶的研究及應用摘要：我國纖維素酶的應用研究近年來取得了很大進展。本文闡述了纖維素酶的發(fā)展，菌種選育，酶的結構，反應機制以及在生活中的應用。關鍵詞：綠色化 催化域 結合區(qū) C1-Cx假說一、纖維素酶的發(fā)展資源和環(huán)境問題是人類在21世紀面臨的最主要的挑戰(zhàn)。生物質(zhì)資源是可再生性資源，地球上年光合作用的產(chǎn)物高達1.5×10112.0×1011t，是人類社會賴以生存的基本物質(zhì)來源。其中90%以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。目前這部分資源尚未得到充分的開發(fā)利用。隨著世界人口迅速增長、礦產(chǎn)資源日漸枯竭，開發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生資源的微生物技術，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)人類急需的燃料

2、、飼料及化工產(chǎn)品，即化工原料的“綠色化”，具有極其重要的意義和光明的發(fā)展前景。纖維素酶的研究，自從1904年在蝸牛消化液中被發(fā)現(xiàn)，至今已經(jīng)歷三個發(fā)展階段。第一階段是80年代以前，主要工作是利用生物化學的方法對纖維素酶進行分離純化。但由于纖維素酶來源廣泛、組分復雜、純化甚為困難，故進展緩慢。第二階段是1980年至1988年，主要工作是利用基因工程的方法對纖維素酶的基因進行克隆和一級結構的測定。Trichoderma reesei的內(nèi)切酶（EG、EG）和外切酶（CBH、CBH）、Cellulomonas fimi的內(nèi)切酶（CenA、CenB、CenC、CenD）和外切酶（CbhA、CbhB、Cex

3、）、Clostridium thermocellum的內(nèi)切酶（CelA、CelB、CelC、CelD）的基因已被克隆和測序，并在大腸桿菌，酵母菌等中得到表達。第三階段是1988年至今，主要工作是利用結構生物學及蛋白質(zhì)工程的方法對纖維素酶分子的結構和功能進行研究，包括纖維素酶結構域的拆分、解析、功能性氨基酸的確定、水解的雙置換機制的確立，分子折疊和催化機制關系的探討。二、纖維素酶菌種選育纖維素分解菌的篩選方法主要有纖維素選擇培養(yǎng)基法、濾紙底物和纖維素天青培養(yǎng)基法、半固體纖維素天青試管法、P-N法和纖維素剛果紅培養(yǎng)基法等。其中，纖維素剛果紅培養(yǎng)基在對纖維素分解菌的準確識別方面具有明顯的優(yōu)越性。纖維

4、素是由葡萄糖殘基以-1.4糖苷鍵連接而成的線狀大分子物質(zhì)，在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈。根據(jù)水解圈的大小，可以粗略地估計菌株產(chǎn)酶的情況，提高工作效率。產(chǎn)纖維素酶的微生物包括真菌、細菌和放線菌。其中主要的有：康氏木霉、黑曲霉、斜臥青霉、芽孢桿菌等。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，而嗜堿細菌產(chǎn)生的纖維素酶在堿性范圍起作用。三、酶的分子結構1纖維素酶分子結構域的拆分1986年Tilbeurgh1用木瓜蛋白酶有限酶切Trichoderma reesei的CBH分子得到具有獨立活

5、性的兩個結構域：一個是具有催化功能的催化域（catalytic domain,CD），另一個是具有結合纖維素功能的纖維素結合（吸附）區(qū)（cellulose binding domain,CBD），之后用類似的方法在多種細菌和真菌的纖維素酶中發(fā)現(xiàn)類似的結構。CBD在纖維素酶中位于氨基端或羧基端，它通過一段高度糖基化的linker與催化區(qū)相連。細菌纖維素酶的linker富含Pho、Thr，而真菌纖維素酶的linker富含Gly、Ser、Thr；細菌纖維素酶的CBD與 CD夾角為135°，而真菌為180°；細菌纖維素酶有兩個酶切位點可將CBD與linker分別切去，而真菌纖維素酶

6、一般只有一個酶切位點可將CBD與linker一同切去。由于纖維素全酶分子呈蝌蚪狀、其linker高度糖基化且具有較強柔韌性，故很難得到結晶.而結構域的拆分使呈球形催化域的結晶成為可能，為纖維素酶的結構和功能研究開辟了道路。2催化域結構和功能的研究采用X光衍射的方法1990年Rouvinen2對T.reesei的CBH的催化域、1992年Juy3對C.thermocellum的CelD的催化域、1993年Spezio4對T.fusca的E2的催化域、1994年Divne5對T.reesei的CBH的催化域進行了結晶和解析。三維結構的研究為內(nèi)切酶和外切酶底物的特異性作出了合理的解釋：內(nèi)切酶的活性位

7、點位于一個開放的cleft中，它可結合與纖維素鏈的任何部位并切斷纖維素鏈；外切酶的活性位點位于一個長Loop所形成的tunnel里面，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。1995年Meinke6利用蛋白質(zhì)工程的方法將C.fimi的外切酶CbhA分子的Loop刪除后，發(fā)現(xiàn)該酶的內(nèi)切酶活性果然提高，這進一步證實了上述分析。1990年Sinnott7從化學機制的角度出發(fā)論述了酶催化糖基轉(zhuǎn)移的機制，他認為糖苷配基的離去是涉及到兩個氨基酸殘基的酸堿催化的雙置換反應，這實際與溶菌酶的作用機制是相似的。1988年至1994年采用定點突變技術和酶專一性抑制劑做了大量研究812，終于證明Glu位于細菌、

8、真菌的內(nèi)切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位點；在異頭碳原子位通過構型的保留或構型的轉(zhuǎn)化完成催化反應, 其中兩個保守的羧基氨基酸分別作為質(zhì)子供體和親核試劑13，14水解雙置換機制得以證明。3 纖維素結合（吸附）區(qū)結構和功能的研究自從1986年Tilbeurgh用木瓜蛋白酶有限酶切T.reesei的CBH分子發(fā)現(xiàn)CBD以來，之后用類似的方法和序列缺失的方法在多種細菌、真菌的纖維素酶和半纖維素酶中發(fā)現(xiàn)了CBD。1995年Tomme15根據(jù)CBD分子大小及氨基酸的相似性將已知的CBD分成了10個家族，大部分的CBD位于家族、。家族的CBD包括3340個氨基酸殘基，所有真菌的CBD都屬于家族；家族的CBD

9、包括95108個氨基酸殘基，C.fimi的CBD都屬于家族；家族的CBD位于那些能產(chǎn)生纖維小體的梭菌中。1989年Kraulis16用核磁共振的方法對T.reesei CBH的CBD、1995年Xu17對C.fimi Cex的CBD的三維結構進行了研究；1996年Tormo18用X光衍射的方法對thermocellum的Cip的CBD三維結構進行了研究。圖1為它們的結構比較：盡管它們在分子大小和折疊構型上不同（CBH的CBD是一個折疊片形成的契形結構，一面疏水、一面親水，疏水面與底物表面接觸；而后兩者是2個折疊片面對面形成的一個-sandwich），但它們的吸附面是相似的，都比較平坦、暴露了幾

10、個芳香族氨基酸（CBH的CBD是3個Tyr， Cex的CBD是2個Trp)及一些潛在的氫鍵形成殘基。圖1CBD的骨架結構(a)T.reesei CBH的CBD;(b)C.fimi Cex的CBD。CBD功能的研究。CBD的去除實驗19表明：纖維素酶去除CBD后對可溶性底物活力影響較小，而對結晶纖維素的吸附和水解活力則有明顯降低?；瘜W突變和定點誘變20，21表明芳香族氨基酸在與結晶纖維素的吸附中發(fā)揮重要作用，它們的突變會導致CBD對結晶纖維素的吸附能力極劇下降。序列比較22表明與CBH的CBD同族的幾個CBD是用Phe或Trp代替了Tyr。目前人們推測：CBD可能通過芳香環(huán)與葡萄糖環(huán)的堆積力吸附

11、到纖維素上，由CBD上其余的氫鍵形成殘基與相鄰葡萄糖鏈形成氫鍵將單個葡萄糖鏈從纖維素表面疏解下來，以利于催化區(qū)的水解作用。纖維素酶分子結構和功能的研究使其對纖維素分子鏈-1,4糖苷鍵作用的底物特異性、水解機制作出了基本闡明。但關于CBD是如何吸附到纖維素表面、吸附后CBD是如何與催化區(qū)相互作用降解纖維素的問題目前尚未作出合理解釋，因為它涉及到纖維素聚合物解鏈、解聚等超分子結構的變化。這一問題的解決將會為有效工程菌的構建、經(jīng)濟利用纖維素打下基礎。四、纖維素酶的反應機制纖維素酶反應和一般酶反應不一樣，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結構極其復雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用

12、代替了酶與底物形成的ES復合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1-Cx假說，該假說認為必須以不同的酶協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協(xié)同作用一般認為是(C1酶)首先進攻纖維素的非結晶區(qū)，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個葡萄糖。不過，纖維素酶的協(xié)同作用順序不是絕對的，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，C1-Cx和-葡聚糖苷酶必須同時存在才能水解天然纖維素。若先用C1酶作用結晶纖維素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此順序作

13、用卻不能將結晶纖維素水解。五、酶的應用1 在發(fā)酵工業(yè)中的應用曲音波等在對斜臥青霉發(fā)酵過程研究的基礎上，結合抗性菌株的選育成功地用亞銨紙廠廢液、廢渣生產(chǎn)纖維素酶。他們選用一株抗黑液抑制物的斜臥青霉J UA10，以亞銨法制漿的蒸煮廢液（黑液）和3%的細小纖維作培養(yǎng)基，采用雙階段變溫培養(yǎng)（生長溫度34，產(chǎn)酶溫度28）等措施，發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。在50L發(fā)酵罐中進行的全廢料培養(yǎng)基產(chǎn)酶實驗顯示，接種48h后酶活可達4.61 IU/ml，發(fā)酵周期較短，酶產(chǎn)率達100IU/(L·h)，單位底物的酶得率達264IU/g纖維素。通過使用補料分批技術，在48h后向發(fā)酵罐中間歇補入少量細雜纖維，可使酶活進一

14、步提高到7.2 IU/ml，但發(fā)酵周期延長。從開辟新能源和解決環(huán)境污染考慮，以廢纖維為原料生產(chǎn)酒精日益受到重視。造紙廠制漿過程中篩除的細雜纖維已經(jīng)過了機械粉碎和化學預處理，脫去了部分木素，纖維素含量達60%70%，容易被酶解發(fā)酵，適宜作為酒精發(fā)酵的原料。20世紀80年代末期采用同時酶解發(fā)酵和補料技術，使細雜纖維的纖維素酒精轉(zhuǎn)化率達到65%，發(fā)酵液酒精濃度達4%。后采用全廢料培養(yǎng)基并補加少量由曲霉菌株產(chǎn)生的高-4葡萄糖苷酶活的粗酶液后，可使纖維素的酒精轉(zhuǎn)化率達70%，原料酒精得率20%，酒精濃度5%以上，可為發(fā)酵工業(yè)所接受。利用備料廢渣配制培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶曲，進而酶解細雜纖維發(fā)酵生產(chǎn)酒

15、精的研究結果顯示，通過采用纖維素酶高產(chǎn)菌和-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌的混合培養(yǎng)，或經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，都可以人為地控制纖維素酶曲的酶系組成，使纖維素的酒精轉(zhuǎn)化率達到50%以上。采用纖維素淀粉共發(fā)酵技術，即在纖維廢渣中添加一定量的玉米面，可使酒精產(chǎn)量大幅度提高，達到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。隨著啤酒生產(chǎn)的快速增長，啤酒糟對環(huán)境的污染日益加劇。目前，啤酒糟大多作低價飼料和肥料直接出售，銷量有限。因其含水量高，不能久貯，易霉爛，從而造成資源浪費。利用纖維素酶水解啤酒糟將酶解液和殘渣分別進行有效利用，可大大提高啤酒糟的經(jīng)濟和環(huán)境效益。梁如玉等利用里斯木霉產(chǎn)生的纖維素酶水解經(jīng)硫酸和高溫、高壓預處理過的啤酒糟，在

16、適宜條件下，100g干啤酒糟可水解得10.8g還原糖，酶解液用于培養(yǎng)酵母菌提取麥角固醇，殘渣是生產(chǎn)菌體蛋白飼料的原料。2 在洗滌劑工業(yè)中的應用以木霉、曲霉屬等真菌產(chǎn)生的酸性纖維素酶主要是將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。近年來，堿性纖維素酶在洗滌劑工業(yè)上的應用改變了傳統(tǒng)的去污機制。堿性纖維素酶與酸性纖維素酶對底物的作用不同。酸性纖維素酶對木質(zhì)纖維素的作用是一個糖化過程，在多種組分的協(xié)同作用下能得到更多的最終產(chǎn)物葡萄糖；而堿性纖維素酶是一種非全組分的內(nèi)切葡萄糖苷酶，主要與棉纖維中僅占10%左右的非結晶區(qū)的纖維素分子起作用。棉纖維吸水性好，但污垢侵入后與水分子結合形成膠狀物而被封閉在纖維素分子結構中，一般

17、洗滌劑不易洗出，而堿性纖維素酶可選擇性地吸附在棉纖維的非結晶區(qū)，使棉纖維膨松，水合纖維素分解，膠狀污垢脫落。所以，堿性的作用對象是棉纖維而不是污垢。宋桂經(jīng)等分離一株芽孢桿菌074，經(jīng)過Sephadex G-100，DEAE-sephadex A-25和Agaorsc 4B三種方法分離純化后，得到一個單組分堿性纖維素酶，其最適反應溫度為50，最適反應pH78，不能分解天然纖維素，CMC對酶的合成無誘導作用。這給工業(yè)化生產(chǎn)中的發(fā)酵和后處理工藝帶來極大方便，酶活較穩(wěn)定，添加于洗滌劑中并不明顯降低棉纖維的牢固度，經(jīng)國家有關部門測試，完全符合國家洗滌劑用酶標準。3 在紡織工業(yè)上的應用紡織品的天然纖維素纖

18、維結構復雜，結晶度高，利用纖維素酶對纖維素纖維織物進行生物整理后，可使紡織物膨松、柔軟、表面光滑，毛羽、棉結明顯地被清除，織物光澤和色澤鮮艷度明顯改善。中國科學院微生物研究所的崔福綿等從生霉棉布上分離出一株產(chǎn)纖維素酶復合物較高的菌株，可用于棉、麻布的拋光處理和牛仔服“石磨”處理，使表面伸出的小纖維末端被除去，有效地減少了織物的起毛和起球，能獲得持久的柔軟度和光滑度，牛仔服用酶水洗比浮石處理損傷要小，且不要額外的柔軟劑，有利于保護環(huán)境，使加工服裝的質(zhì)量優(yōu)良。隨著研究工作的不斷深入，纖維素酶的研究越來越深入，應用也越來越廣。參考文獻1Tilbeurgh H,Tomme P,Claeyssens M

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