亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T和A1298C多態(tài)與胃癌的遺傳易感性

1、亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T和A1298C多態(tài)與胃癌的遺傳易感性                                    作者：李松, 祭美菊, 侯鵬, 何農(nóng)躍   摘要目的：探討代謝葉酸的亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHF

2、R)基因單核苷酸多態(tài)與胃癌風險的關系。方法：以聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)方法分析170例胃癌病人和性別、年齡配對的140例正常對照者的MTHFR基因C677T和A1298C基因型及其與胃癌風險的相關性。結果：在正常對照中，MTHFR基因677CC、CT、TT基因型頻率分別為47.9%、40%和12.1%，而在胃癌病人中分別為35.9%、45.9%和18.2%。在病例組中677(CT+TT)變異型基因者占64.1，顯著高于對照組中的52.1，差異具有顯著意義（2=4.54，P 0.05）。與677CC基因型者相比,變異型基因者和TT型基因者發(fā)生胃癌的危險性分別高1.67倍（OR為1.67,

3、95%CI為1.062.64）和2.67倍（OR為2.67,95%CI為1.3825.341）。A1298C基因型在病例和對照中的分布差異無顯著性意義。但進一步分析發(fā)現(xiàn)，1298變異基因型與677變異基因型之間有協(xié)同作用。攜帶MTHFR 677TT/1298AC基因型個體發(fā)生胃癌的風險是攜帶MTHFR 677CC/1298AA基因型個體的3.684倍 (95%CI為 0.82925.776)。結論： MTHFR單核苷酸多態(tài)是胃癌的遺傳易感性因素。    關鍵詞胃癌；單核苷酸多態(tài)性；亞甲基四氫葉酸還原酶基因；疾病易感性    

4、 DNA 甲基化是基因表達，DNA 的穩(wěn)定性、完整性和誘變的重要決定因素，染色體和DNA甲基化異常都是可遺傳的，是導致基因組不穩(wěn)定性而引發(fā)腫瘤的重要機制1。相關研究表明，細胞內(nèi)低甲基化是胃癌形成的一個重要原因，亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多態(tài)會影響葉酸在體內(nèi)的正常代謝，造成甲基不足，從而促進胃癌的產(chǎn)生，國內(nèi)外刊物報道了此方面進行的一些研究。MTHFR基因在總的人群中呈高度多態(tài)性，在其編碼區(qū)有2個常見的單核苷酸多態(tài),即C677T 和A1298C，前者位于催化區(qū)而后者位于活性調(diào)節(jié)區(qū) 2。作者對江蘇南京地區(qū)的1

5、70例胃癌病人和140例相匹配的正常對照者進行研究，分析MTHFR基因C677T 和A1298C多態(tài)性與胃癌發(fā)生的風險性的關系。    1  材料和方法    1.1  實驗材料    1.1.1  標本來源  標本取自170例胃癌病人和140例正常對照者。病人分別來自東南大學附屬中大醫(yī)院、南京市鼓樓醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院，樣品為腫瘤組織和外周血；年齡、性別相匹配的正常對照者來自東南大學校醫(yī)院和東南大學附屬中大醫(yī)院，所取樣品均為健康人的外周血。所有的病例和正常對照者均

6、為江蘇省南京市及其周邊區(qū)域居住的漢族居民。病例組中男、女性分別為118例和52例，平均年齡為（52.05±10.67）歲；對照組男、女性分別為82例和58例，平均年齡為（50.87±7.69）歲。胃癌組和對照組性別、年齡分布差異無顯著意義（P值分別為0.129和0.28），基因組DNA的提取采用標準的苯酚/氯仿法。    1.1.2  主要試劑  蛋白酶K、EDTA、TrisCl和飽和酚均為上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶Hinf （10Ul-1）和Mbo （10Ul-1）為大連寶生物公司產(chǎn)品，所有的引物由

7、上海博亞生物工程公司合成。    1.1.3  儀器  PTC225熱循環(huán)儀（MJ Research, Watertown, MA），紫外分光光度計（島津公司），凝膠成像系統(tǒng)（Syngene，Gene Genius）。    1.2  實驗方法    1.2.1  MTHFR基因型分析  MTHFR基因分型按我們已報道的方法 3進行。擴增含C677TDNA片段的PCR引物序列為：F，5TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA3和R，5A

8、GG ACG GTG CGG TGA GAG TG3，擴增產(chǎn)物長度為198bp。 擴增含A1298CDNA片段的PCR引物序列為：F，5CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C3和R，5CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG3， 擴增產(chǎn)物長度為163bp。 30l反應體系包括：200gml-1DNA模板1l ，雙側引物各1l，10×緩沖液3l，25mmolL-1的Mg2+ 2l，10mmolL-1的dNTP 0.6l, 1.25U的TaqDNA聚合酶（5Ul-1）。反應條件：94預變性5min，94 30s，62 30s，72 30s，

9、35個循環(huán)，72延伸7min；C677T基因型和A1298C基因型可以分別由限制性核酸內(nèi)切酶Hinf或Mbo鑒別，677突變后可被Hinf識別。純合變異基因型的產(chǎn)物經(jīng)酶切后產(chǎn)生175bp和23bp兩個片段，雜合子產(chǎn)生198、175和23bp3個片段 ,而野生型基因型只有198bp 1個片段。含1298AA的PCR產(chǎn)物有4個Mbo酶切位點 ,產(chǎn)生56、31、30、28和18bp5個片段 ;突變后失去1個酶切位點，因此，純合突變型產(chǎn)生84、31、30和18bp4個片段，雜合子則含84、56、31、30、28和18bp6個片段（圖 1）。取適量PCR 產(chǎn)物分別與足量的限制性內(nèi)切酶于37溫育過夜，酶切

10、產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色。M1. 100bp梯度DNA分子質(zhì)量標志；M2. DL2000型DNA分子質(zhì)量標志；1、4.AC基因型；2、3、5.AA基因型；6.CC基因型圖1  MTHFR基因A1298C多態(tài)擴增產(chǎn)物RFLP圖譜    1.2.2  數(shù)據(jù)處理  在分型結果的統(tǒng)計分析中，病例組和對照組MTHFR基因型的頻率差異以2檢驗確定，P0.05為差異有顯著意義。以比值比（odds ratio，OR）以及95可信度（95% onfidence interval,95%CI）表示各種基因型與胃癌風險的相關性。OR值以非

11、條件的Logistic回歸模型計算，并經(jīng)過年齡、性別等混雜因子校正。所有統(tǒng)計分析均用Statistical Analysis System 軟件（6.1版，SAS公司）計算。                                 2  結  

12、0; 果表1為胃癌與健康對照者的MTHFR基因多態(tài)性分布及其與胃癌的風險關系。對表1中胃癌組和對照組的MTHFR基因C677T和A1298C的基因型頻率進行了遺傳平衡檢測，均符合HardyWeinberg平衡比例（均P0.05），樣本具有群體代表性。表1  MTHFR基因型頻率在病例組和對照組中的 分布及其與胃癌風險的關系注：OR經(jīng)過性別和年齡校對從表1中可以看到在140例正常對照組中，MTHFR基因677CC、CT 和TT 基因型頻率分別為47.9%、40.0%和12.1%。而在胃癌患者中這3 種基因型頻率分別為35.9%、45.9%和18.2%。比較病例組中變異基因型擁有者（CT

13、+TT）占64.1%，顯著高于對照組中的52.1，差異具有顯著意義（2 =4.54，P0.05）。與MTHFR基因677CC基因型者相比，變異型基因者發(fā)生胃癌的危險性為1.67倍（OR為1.67，95%CI為1.062.64）?？梢酝茢郙THFR基因C677T多態(tài)是胃癌的危險因素。以胃癌677CC基因型的OR為1.00，CT基因型的OR為1.60（95%CI為0.9282.639），CT基因型的危險性是CC的1.60倍，經(jīng)統(tǒng)計學分析差異沒有顯著性意義（2 =2.92，P0.05）。TT基因型的OR為2.67（95%CI為1.3825.341），TT基因型的危險性是CC的2.67倍，經(jīng)統(tǒng)計學分析

14、差異有顯著性意義（2 =4.01，P0.05）。OR值的上升趨勢明顯，這提示MTHFR基因C677T的多態(tài)與胃癌風險呈等位基因計量效應關系。對照組中MTHFR第1 298 位基因型的頻率為AA 69.2%、AC 29.3%和CC 1.4%；病例組1298AA、AC 和CC 基因型頻率分別是74.1%、24.7%和1.2%。1298CC基因型頻率在病例組和對照組中都很低，分別只有1.2%和1.4%，與1298AA基因型比較對胃癌風險沒有明顯的影響(OR為1.61，95%CI為0.3091.834)。兩組的MTHFR基因1298AC基因型頻率差異也無顯著意義。因此，可以推斷MTHFR基因A1298

15、C多態(tài)不是胃癌發(fā)生的危險因素。我們進一步分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因677和1298多態(tài)可能存在著聯(lián)合作用。例如，攜帶677TT/1298AA基因型個體的OR為2.035 (95%CI為0.9574.425)，而攜帶677TT/1298AC基因型個體的增高到3.684(95%CI為0.82925.776)。我們還發(fā)現(xiàn)在這些研究對象中，677TT/ 1298AC或677CT/1298CC變異基因型非常罕見，更沒有人攜帶677TT/1298CC基因型 (表2)，可能兩位點均為突變型時可能有致死作用。這一結論與Song等4研究結果相一致。表2  MTHFR基因677和1298基因型聯(lián)合與胃癌風

16、險的關系    3  討    論MTHFR基因677CT和1298AC突變使控制葉酸代謝的MTHFR活性顯著下降，研究表明，MTHFR基因變異型純合子與血漿中同型半胱氨酸水平的升高和5甲基四氫葉酸水平的降低有關5。體外實驗也證實,MTHFR變異型純合子的DNA接受甲基能力顯著高于野生型純合子6。說明MTHFR基因變異導致了作為甲基供體的蛋氨酸合成障礙，進而導致了DNA的低甲基化。細胞基因組DNA的去甲基化可能與細胞的過度增殖有關，研究證明細胞DNA的甲基化水平，特別是有關基因表達控制點的甲基化水平對基因表達起調(diào)節(jié)作用，甲基

17、化水平降低，相關基因的轉(zhuǎn)錄水平就增高。提示MTHFR基因多態(tài)性可能與癌癥的發(fā)生有關。本實驗中我們研究了在葉酸代謝中起關鍵作用的MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)與胃癌遺傳易感性的關系，結果表明MTHFR基因單核苷酸多態(tài)是胃癌的遺傳易感因素。特別是C677T多態(tài)，擁有變異型基因的人數(shù)在病例組中的比例顯著高于對照組，其變異型基因顯著增加了發(fā)生胃癌的危險性。A1298C多態(tài)雖然其基因型頻率與胃癌的發(fā)生沒有顯著意義，但其多態(tài)與MTHFR677多態(tài)可能存在聯(lián)合作用。這一結果不僅表明MTHFR基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有關，同時也提示胃癌的發(fā)生可能與DNA的低甲基化有關。本研究證明MTHFR基因單核苷

18、酸多態(tài)與胃癌風險增高顯著相關，為葉酸攝入低和（或）葉酸代謝障礙可能在胃癌變中起重要作用的假說提供了遺傳學基礎。為了證實MTHFR基因多態(tài)在胃癌病因?qū)W中的作用，有必要進一步研究MTHFR基因多態(tài)與葉酸攝入量之間的基因營養(yǎng)素交互作用以及其他因素如飲酒、吸煙的影響，同時還要對MTHFR基因多態(tài)與不同部位胃癌的遺傳易感性進行研究。這需要在完善病例和對照資料，擴大樣本數(shù)量的基礎上進行。進一步進行這方面的研究對于經(jīng)濟有效地開展胃癌的預防工作具有重要意義。    參考文獻    1HOLLIDAY R, GRIGG G W. DNA methyla

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