a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用實驗方案

1、實驗：-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用背景資料一、酶酶enzyme催化特定化學反響的蛋白質(zhì)、RNA或其復合體。是生物催化劑，能通過降低反響的活化能加快反響速度，但不改變反響的平衡點。絕大多數(shù)酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)。具有催化效率高、專一性強、作用條件溫和等特點。1高效性：酶的催化效率比無機催化劑更高，使得反響速率更快；2專一性：一種酶只能催化一種或一類底物，如蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)水解成多肽；因此在食用酵素當今在功能上，主要有四種：高濃縮SOD酵素如復方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宮肌瘤、卵巢囊腫等腫瘤方面；長生酵素直接補脾補腎補氣血，全面調(diào)理；纖體酵素專門轉(zhuǎn)化脂肪減肥；腸毒清酵素那么專門清理腸皺褶的毒

2、素。3多樣性：酶的種類很多，大約有5000多種，其中可以通過食用補充的酵素達2000多種；形態(tài)上主要有三種：專業(yè)級酵素為酵素膠囊，其次為酵素粉，而液體酵素含量低、效價低、易腐敗而平安性較差一些，食用風險較高。4溫和性：是指酶所催化的化學反響一般是在較溫和的條件下進行的，因此，純粹酵素是中性的，溫和的，不存在副作用，或“好轉(zhuǎn)反響。對于有刺激性而必然存的“好轉(zhuǎn)反響，除了本身腐敗以外，也有可能有藥品的添加。5活性可調(diào)節(jié)性：包括抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、反響抑制調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)和變構(gòu)調(diào)節(jié)等。6.易變性：大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，因而會被高溫、強酸、強堿等破壞；7.有些酶的催化性與輔助因子有關(guān)。酶與無機催化劑的比擬

3、酶無機催化劑相同點1改變化學反響速率，本身幾乎不被消耗；2只催化已存在的化學反響；3加快化學反響速率，縮短到達平衡時間，但不改變平衡點；4降低活化能，使化學反響速率加快。5都會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。不同點1） 酶具有高效性，催化效率比一般催化劑高出107-1013；2） 具有高度專一性，只對特定的一種或一類底物起作用；3） 更易受環(huán)境因素和生物體生理條件的影響，酶是蛋白質(zhì)和核酸組成，易變性失活，所以酶在反響時不斷產(chǎn)生和分解；4） 酶的催化活性是被調(diào)節(jié)控制的、有序進行的；5） 條件溫和：常溫常壓，pH接近中性。但酶易受環(huán)境影響而失活，包括溫度、PH值等，例如一般來說動物體內(nèi)的酶最適溫度在35到40之間，

4、植物體內(nèi)的酶最適溫度在40-50之間；細菌和真菌體內(nèi)的酶最適溫度差異較大，有的酶最適溫度可高達70。動物體內(nèi)的酶最適PH大多在6.5-8.0之間，但也有例外，如胃蛋白酶的最適PH為1.8，植物體內(nèi)的酶最適PH大多在4.5-6.5之間。另外，反響中反響產(chǎn)物和酶的分工和回收困難等缺點限制了酶在工業(yè)上的廣泛應用。二、固定化酶及其應用固定化酶immobilized enzyme，就是將水溶性的酶用物理或化學的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。酶本身還是溶于水的，只是是用物理的或化學的方法使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝膠或半透膜的微囊體從而導致流

5、動性降低。固定化酶的形式多樣，可制成機械性能好的顆粒裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)；或在反響器中進行批式攪拌反響；也可制成酶膜、酶管等應用于分析化學；又可制成微膠囊酶，作為治療酶應用于臨床?，F(xiàn)在又有人用酶膜包括細胞、組織、微生物制成的膜與電、光、熱等敏感的元件組成一種裝置稱生物傳感器，用于測定有機化合物和發(fā)酵自動控制中信息的傳遞及環(huán)境保護中有害物質(zhì)的檢測。最常用的是酶膜與離子選擇電極組成的生物傳感器，例如脲傳感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧電極組成，脲經(jīng)脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又繼續(xù)被硝化菌氧化，總耗氧量那么通過氧電極反映出電流的變化，用以計算脲的含量。 1、天然酶的缺點1天然酶通常對強酸、強堿、

6、高溫和有機溶劑等條件非常敏感，容易失活2溶液中酶很難回收，不能再次利用，提高了生產(chǎn)本錢3反響后，酶會混在產(chǎn)物中，影響產(chǎn)品質(zhì)量，難以在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用2、固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點缺點固定化酶極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；可以再較長時間內(nèi)進行反復分批反響和裝柱連續(xù)反響；在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；酶反響過程能夠加以嚴格控制產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；較游離酶更適合于多酶反響；可以增加產(chǎn)物的收率；酶的使用效率提高，本錢降低。 固定化時，酶活力有損失； 增加了生產(chǎn)的本錢，工廠初始投資大； 只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜； 與完整菌體相比不適宜于多酶反

7、響，特別是需要輔助因子的反響；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的別離程序。三、酶的固定法1、吸附法物理吸附法：將酶吸附到固體吸附劑外表的方法，固體吸附劑有機載體如纖維素，無機載體如活性碳、多孔玻璃等酶與載體形成范德華力備注：范德華力也叫分子間力。分子型物質(zhì)能由氣態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，這說明分子間存在著相互作用力，這種作用力稱為分子間力或范德華力。分子間力有三種來源，即色散力、誘導力和取向力。色散力是分子的瞬時偶極間的作用力，它的大小與分子的變形性等因素有關(guān)。一般分子量愈大，分子內(nèi)所含的電子數(shù)愈多，分子的變形性愈大，色散力亦愈大。誘導力是分子的固有偶極與誘導偶極間的作用力，它的大小與分子的極性和變形性

8、等有關(guān)。取向力是分子的固有偶極間的作用力，它的大小與分子的極性和溫度有關(guān)。極性分子的偶極矩愈大，取向力愈大；溫度愈高，取向力愈小。離子交換法：利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，使其帶有電荷的基團，與離子交換及形成離子鍵，而被交換結(jié)合到交換劑上2、包埋法將酶包埋在多孔載體中，包埋成格子型或微膠囊性，常用載體：聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素、海藻酸鈉凝膠包埋法的原理是將酶截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中。通過聚合作用或者離子網(wǎng)絡(luò)形成，或通過沉淀作用，或改變?nèi)軇囟?、pH值使細胞截流。凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)可以阻止酶的泄漏，同時能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴散出來。3、載體結(jié)合法最常用的是共價結(jié)合法，即酶蛋白的非必需基

9、團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯(lián)的蛋白質(zhì)基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結(jié)合的基團，不能是酶表現(xiàn)活力所必需的基團。4、交聯(lián)法：是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生反響，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。但是交聯(lián)法中酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。后附酶的固定法詳細介紹四種方法的比擬實驗目的1能夠制備固定化的-淀粉酶 2能夠說出固定化的-淀粉酶水解淀粉的測定的原理并且會獨立操作此過程實驗原理一、選

10、擇石英砂做吸附劑原因 1.石英砂本來是不帶電的，其上之所以有電荷是因為：石英砂外表的硅原子水合后產(chǎn)生硅烷醇基團SiOH,硅烷醇基團可以通過攝入水體中的H+和OH-而帶電：SiOH2+ +H2O SiOH+H+SiO-+ H2OSiOH+OH- 當石英砂外表為SiOH2+，蛋白質(zhì)在大于其等電點時，其帶負電荷，被石英砂外表的正電荷吸附；但石英砂外表為SiO-時，溶液中的Ca離子就會起到橋聯(lián)作用，在溶液中Ca離子存在以下平衡：Ca2+OH-CaOH+CaOH+Ca(OH)2Ca(OH)+在吸附過程中起著至關(guān)重要的作用，它的多少決定了石英砂外表的負電荷的轉(zhuǎn)化率的多少，也就決定了石英砂對蛋白質(zhì)的吸附率的

11、上下。當pH的值為11.00左右時，雖然石英砂外表的負電荷的轉(zhuǎn)化率較低，但是溶液中負電荷大大增加，導致石英砂外表上的負電荷密度增加，這成為主導因素，會使Ca離子的平衡向左移動，CaOH+也適當增加，石英砂外表的負電荷的轉(zhuǎn)化率增高，外表逐漸帶正電荷，蛋白質(zhì)在大于其等電點時帶負電荷，石英砂從而起到吸附蛋白質(zhì)的作用。2.石英砂外觀呈多棱形、球狀，具有機械強度高、截污能力強、耐酸性能好等特點。石英砂濾料起到過濾作用，就像水經(jīng)過砂石滲透到地下一樣，將水中的那些懸浮的物阻攔下來，主要針對那些細微的懸浮物。3.利用石英砂的理化性質(zhì)，它不會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即不會破壞酶的活性。.二、淀粉酶淀粉酶一般作用于可溶

12、性淀粉、直鏈淀粉、糖元等1，4-葡聚糖，水解1，4-糖苷鍵的酶。根據(jù)作用的方式可分為-淀粉酶EC3211與-淀粉酶EC3212。1-淀粉酶廣泛分布于動物唾液、胰臟等、植物麥芽、山萮菜及微生物。微生物的酶幾乎都是分泌性的。此酶以Ca2+為必需因子并作為穩(wěn)定因子，既作用于直鏈淀粉，亦作用于支鏈淀粉，無差異地切斷1，4-鏈。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反響的消失，最終產(chǎn)物在分解直鏈淀粉時以麥芽糖為主，此外，還有麥芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支鏈淀粉時，除麥芽糖、葡萄糖外，還生成分支局部具有-1，6-鍵的-極限糊精。一般分解限度以葡萄糖為準是35-50，但在細菌的淀粉酶中，亦有呈

13、現(xiàn)高達70分解限度的最終游離出葡萄糖；2-淀粉酶與-淀粉酶的不同點在于從非復原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷1，4-葡聚糖鏈。主要見于高等植物中大麥、小麥、甘薯、大豆等，但也有報告在細菌、牛乳、霉菌中存在。對于象直鏈淀粉那樣沒有分支的底物能完全分解得到麥芽糖和少量的葡萄糖。作用于支鏈淀粉或葡聚糖的時候，切斷至1，6-鍵的前面反響就停止了，因此生成分子量比擬大的極限糊精。從上述的-淀粉酶和-淀粉酶的作用方式，分別提出1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶1，4glucan 4-glucanohydrolase和 1， 4-葡聚糖-麥芽糖水解酶-1，4glucan maltohydrolase的名稱等而被

14、使用。-淀粉酶-淀粉酶-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉時可從分子內(nèi)部隨機地切開淀粉鏈的-1，4糖苷鍵，而生成糊精和復原糖，產(chǎn)物的末端殘基碳原子構(gòu)型為-構(gòu)型，故稱-淀粉酶。1、性質(zhì)和特征-淀粉酶和其它酶類一樣，具有反響底物特異性，不同來源的淀粉酶反響底物也各不相同，通常-淀粉酶顯示出對淀粉及其衍生物有最高的特異性，這些淀粉及衍生物包括支鏈淀粉、直鏈淀粉、環(huán)糊精、糖原質(zhì)和麥芽三糖等。pH和最適溫度反響溫度和pH對酶活力影響較大，不同來源的-淀粉酶有各自的最適作用pH和最適作用溫度，通常在最適作用pH和最適作用溫度條件下酶相比照擬穩(wěn)定，在此條件下進行反響能最大程度地發(fā)揮酶活

15、力，提高酶反響效率。因此，在工業(yè)應用中應了解不同的酶最適pH和最適溫度，確定反響的最正確條件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。通常情況下-淀粉酶的最適作用pH一般在2到12之間變化。真菌和細菌類-淀粉酶的最適pH在酸性和中性范圍內(nèi)，如芽孢桿菌-淀粉酶的最適pH為3，堿性-淀粉酶的最適pH在912。另外，溫度和鈣離子對一些-淀粉酶的最適pH有一定的影響，會改變其最適作用范圍。不同微生物來源的僅一淀粉酶的最適作用溫度存在著較大差異，其中最適作用溫度最低的只有2530，而最高的能到達100130。另外，鈣離子和鈉離子對一些酶的最適作用溫度也有一定的影響12。-淀粉酶是金屬酶，很多金屬離子，特別

16、是重金屬離子對其有抑制作用；另外，巰基，N-溴琥珀酸亞胺，p-羥基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等對僅一淀粉酶也有抑制作用。-淀粉酶中至少包含一個Ca2+，Ca2+使酶分子保持適當?shù)臉?gòu)象，從而維持其最大的活性和穩(wěn)定性。Ca2+對僅一淀粉酶的親和能力比其它離子強，其結(jié)合鈣的數(shù)量在1到10之間。結(jié)晶頂峰淀粉酶A(TAA)包含10個Ca2+，但只有一個結(jié)合很牢固。通常情況下結(jié)合一個Ca2+就足以使-淀粉酶很穩(wěn)定。用EDTA透析或者用電滲析可以將Ca2+從淀粉酶中除去，參加Ca2+可以激活鈣游離酶。用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+過量的情況下也能使其結(jié)晶。

17、參加Sr2+、Mg2+和Ba2+離子可以激活用EDTA失活的TAA。通常情況下，有Ca2+存在淀粉酶的穩(wěn)定性比沒有時要好，但也有報道-淀粉酶在Ca2+存在時會失活，而經(jīng)EDTA處理后卻保存活性，另外，有報道稱Ca2+對僅一淀粉酶沒有影響。實驗結(jié)果說明，不同強度電場導致酶活性增加的效應不同，并且呈非單調(diào)性變化。我們認為，不同強度電場對酶蛋白分子的構(gòu)象產(chǎn)生了不同影響，處理酶所用的電場能量雖然缺乏以改變酶蛋白氨基酸序列，但可以改變酶蛋白的構(gòu)象姚占全等13用不同強度電場處理-淀粉酶5min，處理后分別在第1天與第1O天測定電場對-淀粉酶活性的影響。第1天測定結(jié)果說明，電場對酶產(chǎn)生明顯影響，而且不同強度

18、電場對-淀粉酶活性的影響程度不同，在0.56.0kVcm范圍內(nèi)，酶活性隨場強增加呈非單調(diào)性變化，與對照組相比，變化幅度在5.5%26.2%之間。第1O天測定，酶活性變化幅度在0.216.3%之間，說明電場對酶產(chǎn)生的影響經(jīng)過一定時間后趨于消失。2、在本次實驗中的作用葡萄糖麥芽糖-淀粉酶-淀粉酶-淀粉酶只將淀粉水解為糊精，淀粉溶液參加KI-I2指示溶液時顯現(xiàn)藍色，而轉(zhuǎn)變成糊精后顯現(xiàn)紅色。原理：淀粉跟碘生成的包合物的顏色，跟淀粉的聚合度或相對分子質(zhì)量有關(guān)。在一定的聚合度或相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)，隨聚合度或相對分子質(zhì)量的增加，包合物的顏色的變化由無色、橙色、淡紅、紫色到藍色。例如，直鏈淀粉的聚合度是200

19、980或相對分子質(zhì)量范圍是32 000160 000時，包合物的顏色是藍色。分支很多的支鏈淀粉，在支鏈上的直鏈平均聚合度2028，這樣形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，顯棕紅色、紅色、淡紅色等。淀粉糊精糖化淀粉酶遇碘不顯色遇碘顯紅色遇碘顯藍色將吸附有-淀粉酶的石英砂裝柱，使淀粉溶液流過柱，假設(shè)柱的流出液在參加KI-I2溶液時可看到溶液呈現(xiàn)紅色，說明水解產(chǎn)物中有糊精。-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后，酶的穩(wěn)定性增加，包括酶對熱的穩(wěn)定性，對蛋白酶的抵抗能力、對各種試劑的穩(wěn)定性都不同程度地增加。由于穩(wěn)定性增加，保存期也相應延長，數(shù)日內(nèi)酶活力不減。低溫保存酶的原理:酶都有一個共性，高溫會使其失去活

20、性，因為酶本質(zhì)上大局部是蛋白質(zhì)，低溫4能夠抑制酶的活性但又不會使其失活，故能夠保存酶，在使用時恢復其最適溫度即可發(fā)揮酶的催化功能。三、KI-I2溶液1、配方100ml蒸餾水2、配制固態(tài)碘是非極性分子晶體，難溶于極性較強的水中，在25時，1 升水中只能溶解0.3 克碘。實驗室使用的碘水要求有比擬大的濃度。為了得到濃度較大的碘水，可先向水中參加少量碘化鉀晶體，然后再參加碘的晶體。這是由于在含有碘離子的溶液中，每個碘離子可以跟一個碘分子結(jié)合，生成三碘離子I3-。生成的I3-離子能夠離解成碘和碘離子，溶液中有以下平衡存在：I-I2 I3-當反響需要碘時，上述平衡即向左方移動，使溶液內(nèi)有碘供給，所以含有

21、I-3 離子溶液的性質(zhì)與含有I2 的溶液即碘水的性質(zhì)相似。注：將此液保存在棕色玻璃瓶內(nèi)。 3、在本次實驗中的作用用稀釋的碘-碘化鉀溶液與淀粉作用時，形成碘化淀粉，呈藍色的特殊反響，所以常用碘-碘化鉀溶液鑒定淀粉。淀粉的水解物糊精遇碘變紅。糖原遇碘變紅褐色。糊粉粒是植物細胞中貯藏蛋白質(zhì)的主要形式，當?shù)?碘化鉀溶液與細胞中的蛋白質(zhì)作用時，呈黃色反響，因此鑒定蛋白質(zhì)常用的方法也是用碘-碘化鉀溶液，但濃度較大效果才好。四、淀粉1、淀粉的相關(guān)特性及其分類淀粉是葡萄糖的高聚體，在餐飲業(yè)又稱芡粉，通式是(C6H10O5)n，水解到二糖階段為麥芽糖，化學式是C12H22O11，完全水解后得到葡萄糖，化學式是C

22、6H12O6 。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類。淀粉是植物體中貯存的養(yǎng)分，貯存在種子和塊莖中，各類植物中的淀粉含量都較高。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類。直鏈淀粉含幾百個葡萄糖單元，支鏈淀粉含幾千個葡萄糖單元。在天然淀粉中直鏈的占20%26%，它是可溶性的，其余的那么為支鏈淀粉。當用碘溶液進行檢測時，直鏈淀粉液呈顯藍色，而支鏈淀粉與碘接觸時那么變?yōu)榧t棕色。原因是：具有長螺旋段的直鏈淀粉可與長鏈的聚I3 形成復合物并產(chǎn)生藍色。直鏈淀粉碘復合物含有19%的碘。支鏈淀粉與碘復合生成微紅紫紅色，這是因為支鏈淀粉的支鏈對于形成長鏈的聚I 3 而言是太短了。直鏈淀粉-淀粉酶作用于直鏈淀粉，在這里對直鏈淀粉做一

23、個簡單介紹。直鏈淀粉是D-葡萄糖基以a-(1,4)糖苷鍵連接的多糖鏈，分子中有200個左右葡萄糖基，分子量12105，聚合度990，空間構(gòu)象卷曲成螺旋形，每一回轉(zhuǎn)為6個葡萄糖基。特性1直鏈淀粉具有抗?jié)櫭浶?，水溶性較差，不溶于脂肪；2直鏈淀粉不產(chǎn)生胰島素抗性；3直鏈淀粉糊化溫度較高，糯淀粉為73，而直鏈淀粉為81.35；4直鏈淀粉的成膜性和強度很好，粘附性和穩(wěn)定性較支鏈淀粉差；5)直鏈淀粉具有近似纖維的性能，用直鏈淀粉制成的薄膜，具有好的透明度、柔韌性、抗張強度和水不溶性，可應用于密封材料、包裝材料和耐水耐壓材料的生產(chǎn)。含有直鏈淀粉的食物食品類型簡介膨化食品因粘滯力、膨脹度、水分等不同，直鏈淀粉

24、和支鏈淀粉有顯著不同的膨化效果，直鏈淀粉有更強的抗拉伸力，成型性好，能夠增加產(chǎn)品的脆性和強力；支鏈淀粉在其中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有助于增大膨化體積，增強食品的松脆性。要得到最大膨化體積，并非支鏈淀粉含量越高越好，而是一個適宜的直支比，兩種成分有相互制約作用，有一個最正確的配比，實際加工中常通過調(diào)節(jié)不同的直支比來得到不同的效果。低脂食品在保健食品方面，直鏈淀粉可作為低脂肪、低熱量食物添加物，其水解產(chǎn)物可替代食品中的脂肪。美國的快餐業(yè)很興旺，但由于這類食品的高油、高脂性，許多人對此敬而遠之，以高直鏈淀粉作為油脂、奶油的代替物解決了這一問題，如在某些冰激凌中以直鏈淀粉代替大量奶油，在夾心餅干中以直鏈淀粉代

25、替油脂等，制成“低脂食品。研究說明用高直鏈玉米淀粉作為脂肪代替物制成的低脂食品，具有很好的流變學特性及穩(wěn)定性，與全脂奶油產(chǎn)品具有相同的口感，且生產(chǎn)過程只需原來的生產(chǎn)線，不需添加另外的設(shè)備。食品添加劑直鏈淀粉和支鏈淀粉或不同直/支比的淀粉作為食品添加劑的效果不同。適宜直/支比的淀粉作為罐頭、飲料、口服液等飲品的添加劑，溶液不分層，固液相均穩(wěn)定、不沉降、口感好；作為香腸、冰淇淋等的凝固劑，口感滑嫩細膩；用于糕點、奶酪可使其松軟可口；用作飴糖、口香糖以及化裝品等的添加劑都較普通淀粉好。玉米粉絲制玉米粉絲必須選用直鏈淀粉含量高的玉米品種如金皇后、馬牙齒，原因是直鏈淀粉在糊化冷卻后，它的分子會重新結(jié)晶，

26、從而使粉絲具有一定的拉力，而支鏈淀粉含量相對高的品種，其淀粉湖化后，不會發(fā)生明顯的重結(jié)晶化，不能用來制粉絲。五、關(guān)于本實驗操作的根本原理實驗器材實驗步驟與方法實驗結(jié)果記錄表對實驗的預期思考題附錄：酶的固定方法吸附法吸附法包括物理吸附法和離子交換吸附法。物理吸附法各種物理吸附法使用的載體，通常都有巨大的比外表，因而存在巨大的外表剩余能，能夠吸附其它物質(zhì)，其中包括酶。這種吸附作用選擇性不強，吸附不牢。常用于酶固定化的載體(吸附劑)有：無機載體，如活性氧化鋁、活性炭、皂土、硅藻土、高嶺土、多孔玻璃、硅膠等；有機載體，如：面筋、淀粉、纖維素、膠原、賽璐珞和火棉膠等。無機吸附劑的吸附容量一般很低，常小于

27、lmg(蛋白)克(吸附劑)，少數(shù)有達17mg者，如氧化鈦欽包被的不銹鋼粒(直徑100200m)，吸附-半乳糖苷酶即是。有機吸附劑的吸附容量要高一些，常達數(shù)十毫克克(吸附劑)、如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸酪酶等，可達70mg(蛋白)cm-2(膜)；每l克膠原膜，可吸附溶菌酶服酶、葡萄糖氧化酶50mg之多。國產(chǎn)微孔玻璃載體吸附葡萄糖淀粉酶，得到4一8的蛋白含量，是一種優(yōu)良的載體。無機吸附劑在固定化之后，常引起吸附變性，損失活力回收率。有人將糖化酶與陰離子外表活性劑反響后，再用活性炭吸附，酶活力高，且長期穩(wěn)定。用多孔硅(CPGl00，孔徑100nm)固定化-淀粉酶和糖化酶時，添加鈦鹽所制備的固

28、定化酶，其活力比用戊二醛交聯(lián)法制備者高兩倍。這說明無機吸附劑配合其它方法使用，可能更好。可惜這方面的規(guī)律性知識很少。離子交換吸附法這是一種電性吸附。常用的載體有：DEAE-纖維素、CM-纖維素、DEAE葡聚糖凝膠，還有DEAE纖維素、AmberliteIRA-93、纖維素-檸檬酸鹽、IR50、120、200、Dowex-50等。這類載體一般每克可吸收50-150mg蛋白。中國科學院微生物所固定化酶組，用DEAESephadexA-50吸附葡萄糖淀粉酶，固定化酶的表觀活力為1400Ug-1,天津工業(yè)微生物所，以強堿陰離子交換樹脂290制備葡萄糖異構(gòu)酶，固定化酶活力達9000-15000Ug-1,

29、活力回收率86一92，果糖轉(zhuǎn)化率42。包埋法將酶分子包埋于凝膠的網(wǎng)眼中或半透性的聚合物膜腔中，以到達固定化之目的的方法，即稱包埋法；格子型包埋法常用的凝膠有聚丙烯酰胺凝膠、硅橡膠、卡拉膠，還有人用過大豆蛋白質(zhì)、合成纖維。王厚行等先后報道用廉價的PVC(聚氯乙烯)包埋脲酶和乳酸脫氫酶，制備酶電極，效果優(yōu)于聚丙烯酰胺包埋法。以聚丙烯酰胺(PAG)包埋法為例，包埋酶的制備與PAGE凝膠制備類同。即將lml溶于適當緩沖溶液的酶液，加于3m1含750mg丙烯酰胺單體和40mgN，N5的二甲氨基丙氰和1的過硫酸鉀，作為加速劑和引發(fā)劑，混勻保溫(23nm，底物和產(chǎn)物可進出凝膠網(wǎng)眼，而酶分子不透出。FAG的包

30、埋容量在10一100mg(蛋白)g-1(單體)之間。微囊型包埋法本法是以超濾用的半透膜包裹含酶的液滴而成；它大多用于醫(yī)療。例如天冬酰胺酶，就可以做成囊型酶使用。微囊包埋法按制作特征可分為界面聚合法、液體枯燥法、分相法和液膜(脂質(zhì)體)法四種。界面聚合法是將疏水和親水單體，在界面進行聚合，使酶包被其中而成。具體方法：將酶的水溶液和親水單體，用一種與水不混合的有機溶劑作成乳化液，再將溶于同一有機溶劑的疏水單體溶液，在攪拌下參加上述乳化液中。在乳化液中的水相和有機溶劑相之間的界面發(fā)生聚合反響，這樣，水相中的酶即包被于聚合膜內(nèi)。例如，將親水單體乙二醇或多酚與疏水單體多異氰酸結(jié)合而成聚脲膜。用聚脲制備天冬

31、酰胺酶、脲酶等微囊。液體枯燥法是將一種聚合材料溶于一種沸點低于水、且不與之混合的溶劑中，參加酶的水溶液，并用油溶性外表活性劑為乳化劑，制成乳化液。此為“水在油中乳化液，把它分散于含有明膠(或丙烯醇)和外表活性劑的水溶液中，形成第二乳化液。在不斷攪拌下，真空枯燥，即成含酶微囊。常用的聚合材料為乙基纖維素、聚苯乙烯、氯橡膠等。常以苯、環(huán)己烷和氯仿為溶劑。此法曾制備過氧化氫酶、脂肪酶等的乙基纖維素和聚苯乙烯微囊，微囊制備的酶幾乎不失活。但很難完全除去殘留的有機溶劑。囊的直徑幾十到幾百微米，膜厚約25nm，大小可由聚合物濃度、乳化速度和保護性膠的選擇任意調(diào)制。分相法又稱界面凝聚法是利用某些高聚物在水相

32、和有機相界面上有極低溶解度，因而易形成皮膜將酶包被的方法。例如將含酶水溶液在含有硝酸纖維素的乙醚溶液中乳化分散，然后一邊攪拌，一邊滴加能和乙醚互溶但不能溶解硝酸纖維素的另一有機溶劑苯甲酸丁脂。這時乳化液滴周圍的硝酸纖維素凝聚成膜囊，而將酶的水溶液包圍其中。如以乙基纖維素為材料，那么用四氯化碳溶解，而用石油醚使乳滴凝聚成囊。液膜法或稱脂質(zhì)體(Liposome)法是由磷脂分散于酶水溶液而形成脂質(zhì)囊包埋酶液的方法。此法的最大特征是底物和或產(chǎn)物穿過液膜時，與膜的孔徑無關(guān)，而與其對膜組分的溶解度有關(guān)。因此，其用途將有新的開展。載體偶聯(lián)法(共價法)此法是將酶分子的必需基團經(jīng)共價鍵與載體結(jié)合的方法。就蛋白而

33、言，可供反響的非必需側(cè)鏈基團有一NH2、一OH、一COOH、一SH2、酚環(huán)、咪唑基、吲哚基。就載體而言，常用的載體，有多羥基聚合物如纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂糖等；多胺基聚合物，如聚丙烯酰胺凝膠、多聚氨基酸。還有一些其他的載體如聚苯乙烯、尼龍、多孔玻璃等。這些載體的功能基團有：芳香氨基、羥基、羧基、羧甲基和氨基等。酶分子側(cè)鏈與載體功能基之間，往往不能直接反響，因而反響前必須事先將載體功能基團加以活化，然后與酶分子反響而固定化?；罨团悸?lián)反響多種多樣，這里擇要介紹幾種。重氮化法這是一類應用較廣的方法，適用于多糖類的芳香族氨基衍生物、氨基酸共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、乙烯二馬來酸共聚物和多孔玻璃等載體。載體先用亞硝酸處理，生成重氮鹽衍生物，然后在溫和條件下與酶分子的酚基、咪唑基或氨基反響而成鍵。224交聯(lián)法利用雙功能或多功能試劑，使酶分子之間或酶蛋白與其它惰性蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而成固定化酶，此即交聯(lián)法。雙功能和多功能試劑，功能基團相同的，例如戊二醛、二重氮聯(lián)苯胺2，2二磺酸等為“同型雙(多)功能試劑。功能基團不相同者如1，5二氟2，4二硝基苯等，為“雜型雙(多)功能試劑。戊二醛是應用最廣的雙功能試劑，它與酶的游離氨基反響，形成Schiff堿而使酶分子交聯(lián)：交聯(lián)法單用時，所得到的固定化酶，顆粒小、機械性能差、酶