實時熒光定量RT-PCR實驗流程

1、實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCRReal-Time Reverse Transcription PCR（RT-PCR）1 材料 1. 1 儀器756型紫外分光光度計 國產(chǎn)上海ABI 7300 Real-Time PCR System美國ABI公司RS-28高速低溫離心機德國賀利氏公司超低溫冰箱 德國賀利氏公司UVP凝膠掃描系統(tǒng)美國UVP 公司微量移液器 德國Gilson公司DYZ-22A型雙恒定時電泳儀北京市六一儀器廠DYY-橋式電泳儀北京市六一儀器廠1. 2 試劑RNA提取試劑Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV ），核糖核酸酶抑制劑（RNasin），dN

2、TP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），隨機引物（Random primers），瓊脂糖（agarose）均為美國Promega 公司產(chǎn)品；熒光定量試劑盒：Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司RNA提取:取約100mg組織于冰浴勻漿器中，加入1ml Trizol (Invitrogen,USA)，迅速研磨成勻漿液，加入200 ml氯仿，震蕩30S，冰上放置5 min。4，12000 rpm，離心10 min，取上層水相轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混

3、勻，-20靜置2h。然后4，12000 rpm，離心20 min，棄上清，加入1ml 75%乙醇，輕輕混勻，4，12000 rpm，離心10min，吸凈上清液，于室溫下晾干，加入20ml DEPC處理的去離子水溶解沉淀，-80保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄（RT）:（試劑盒: Promega，USA）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成如下表：Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chainComponentVolume（ml）Concentration5×R.T.buffer*51×dNTP2.510mM/ mlRNasin220U/ m

4、lRNA5.38mgRandom Primer10.1ug/ mlM-MLV65 U/ mlNucleasr-Free Water 3.2Total25 42反轉(zhuǎn)錄50min，95 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。Syber Green 熒光定量PCR檢測：(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI) 儀器型號：ABI 7300 Real-Time PCR System,美國ABI公司PCR反應(yīng)液組成如下表：Table 2 Mixed components for polymerase chain reactionComponent Volume （ul）R.T.product12×Master Mix10Primer1+1H2O7Total20PCR熱循環(huán)參數(shù)：96 4min，然后三步反應(yīng)：94 30S，58 30s，72 30s，進行40個循環(huán)，于每個循環(huán)的第三步即：72 30s收集熒光信號。實時熒光定量PCR結(jié)果分析: 擴增完畢后，進入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值（RQ值），將RQ值用于統(tǒng)計分析