表面等離子共振傳感器在生物檢測中的應用

1、表面等離子共振傳感器在生物檢測中的應用浙江大學省基金項目編號：Z504009項目名稱：基于表面等離子共振原理的雙光束檢測技術與實驗研究1. 前言 表面等離子體子共振(surface plasmon resonance,SPR)是一種物理光學現(xiàn)象1。光在玻璃界面處發(fā)生全內(nèi)反射時的倏逝波，可以引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子波。在入射角或波長為某一適當值的條件下，表面等離子波與倏逝波的頻率和波數(shù)相等，二者將發(fā)生共振，入射光被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰(即反射強度最低值)。當緊靠在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率不同時，共振峰位置將不同。表面等離子激元共振(SPR)的現(xiàn)象最早于五

2、十年代被預言。60年代Otto以及1971年Kretschmann分別發(fā)表了里程碑性質(zhì)的文章，激發(fā)了人們應用SPR于傳感機制的熱情，而Kretschmann結構也為SPR型傳感器奠定了基礎。自1983年Liedberg2將其用于檢測抗原體反應后，SPR以其具有的實時，原位及無損檢測等優(yōu)于其他生物檢測技術的優(yōu)勢，引起了人們越來越濃的興趣?？茖W儀器是從事科學研究的物質(zhì)手段。“工欲善其事，必先利其器”，以至科學研究之成敗決定于探測實驗方法和儀器。SPR技術自80年代初期引入到傳感器界，發(fā)展十分迅猛。曾有人預測，基于SPR的免疫生物傳感器是最具有商品化潛力的一類傳感器。這樣的評價，一方面來源于對FET

3、等傳感器的技術困難的失望和畏懼，另一方面，是受到現(xiàn)代微電子工藝的支持以及廉價儀器就可以實現(xiàn)SPR檢測的鼓舞。如今，SPR傳感器的理論分析、器件研制和實用系統(tǒng)開發(fā)日趨完善。由于SPR技術具有能實時監(jiān)測反應動態(tài)過程、分析樣品不需要純化、生物樣品無需標記、靈敏度較高、無背景干擾等特點，在生物科學領域應用中取得了長足進展。它以其優(yōu)異的靈敏度、實時響應特性引起了科研人員和商業(yè)機構的廣泛重視，被廣泛用于環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)療、食品分析等3，對于生物大分子相互作用機制分析，效果尤其顯著，目前已成功地研制出各種類型的SPR免疫傳感器。生物分子學的發(fā)展，既為SPR型生物傳感器提供了分子識別機制的基礎，又提供了其應用的場

4、所。與FET、熱生物傳感器、與SAW和酶電極技術相比，SPR以其高靈敏度、快速響應、試劑準備簡單和操作簡易而獨樹一幟。目前，基于SPR的生物傳感器及系統(tǒng)已逐漸成熟，對其研究步入高峰期，在具有多樣性和高靈敏度生物傳感器的迫切需求下，開始全面從實驗室走向市場，現(xiàn)在已經(jīng)有一些商用儀器投入科研與醫(yī)藥事業(yè)中。其中最為著名的是BIACORE系列產(chǎn)品。這些系統(tǒng)是在瑞典林平徹大學Liedberg等人的研究基礎上，研制出可以用于基因序列分析、食品檢測抗原抗體分析等方面的生化儀器，都是基于Kretschmann結構，采用專門的SPR系統(tǒng)和獨立的微機相配合，軟件控制液體流量、數(shù)據(jù)記錄及SPR譜的分析，系統(tǒng)實時監(jiān)測，

5、可以連續(xù)數(shù)日工作，自動完成分析過程。但是價格高達幾十萬美元，不適合普遍使用。另外，Quantech、Texas Instruments和EBI等公司也都研制出了自己的SPR儀器系統(tǒng)。2. 折射率測量 SPR傳感器有四種主要的檢測方法：角度調(diào)制4，波長調(diào)制5，相位調(diào)制6，強度調(diào)制7。其中，角度調(diào)制應用最普遍，如今市場上的商用儀器多數(shù)采用角度調(diào)制的方法。 采用角度調(diào)制測量時，入射光波長固定，反射光強度是入射角的函數(shù)，其中反射光強度最低時所對應的入射角稱為共振角。SPR對附著在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率非常敏感,當表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時，共振角將發(fā)生變化。因此，SPR譜（共振角的變化vs時

6、間）能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化。如果在金屬薄膜外側加上一層待測物質(zhì)，試樣與金屬薄膜的耦聯(lián)影響了結構的折射率，從而影響了反射光、衰減波以及等離子體共振。所以，只要測得SPR譜，就可以得到樣品折射率。若采用監(jiān)控的方式，還可以實時反映樣品溶液折射率的動態(tài)變化。3. 生物傳感器用SPR技術雖然可測得緊靠在金屬薄膜表面介質(zhì)層的光學常數(shù)。但是，進一步獲得該介質(zhì)的其他信息才是SPR研究的主要目的。例如通過膜厚估計成膜物質(zhì)的結構排列，通過介質(zhì)的折射率（n），膜厚度(d)和吸收系數(shù)（k）計算吸附物質(zhì)的質(zhì)量，進而求得相互作用生物大分子之間的鍵參數(shù)。將普通的SPR傳感器與生物分子互作技術(biomolec

7、ular interaction analysis，BIA)8相結合，就可以制作全新的SPR生物傳感器件。因為SPR光譜隨金屬表面的折射率變化而變化，而折射率的變化又和結合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比，因而可通過對生物反應過程中SPR光譜的動態(tài)變化獲取生物分子相互作用的特異信號。這樣，它就能在不需使用熒光或同位素標記甚至無須純化各種生物組分的天然條件下，通過傳感器芯片實時監(jiān)測各類生物分子如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖、類脂甚至全病毒、細胞之間相互作用的整個過程，并通過分析軟件獲取生物分子結合解離、親和性特異性、協(xié)同拮抗、反應速率濃度變化等互作動力學參數(shù)。3.1生物分子互作技術（BIA）生物

8、分子相互作用是生命的基礎, 而研究和分析生物分子相互作用的機理及分子結構與功能之間的關系, 對我們在分子水平上了解生物體系至關重要。 眾所周知, 任何生物學方面的研究都可歸結至生物分子相互作用的研究。近年來, 在分子水平上的功能研究技術大量涌現(xiàn), 其中將表面等離子共振傳感器與生物分子相互作用實時分析(BIA) 相結合的技術尤為引人注目。生物分子相互作用分析是利用最新的生物傳感技術對二個或二個以上的生物分子間作用進行實時監(jiān)測，可測定的生物分子包括蛋白質(zhì)、 多肽、核酸、多糖、磷脂及小分子如信號傳導物、藥物等。分析物無需純化或溶于水，可在粗抽提液及附著于磷脂囊、病毒、細菌或真核細胞表面得以測定，與操

9、作復雜、測量周期長傳統(tǒng)檢測技術相比，SPR生物傳感器將測量過程變得方便快捷。3.2 BIA 技術的基本原理BIA 的測定原理是基于表面等離子共振監(jiān)測傳感片表面液體的折射率變化, 而這一變化和傳感片表面所結合生物分子的質(zhì)量成正比(圖1)。因此可在非標記的情況下監(jiān)測生物分子間的相互作用。圖1 SPR生物傳感器圖當進行分子間相互作用分析時, 將其中一個反應物(稱為配體) 偶聯(lián)在傳感片上, 含有另一個反應物(稱作分析物) 的樣品通過蠕動泵以恒定的流速通過傳感片表面, 分子間有結合反應而導致傳感片表面分子濃度的變化將由SPR 信號的改變而得到測定, 并以共振單位(RU) 作表達。以時間對共振單位(RU)

10、 連續(xù)作圖, 得到的傳感圖記錄了整個反應過程包括結合和解離過程(圖2)。當一輪反應結束后, 結合在傳感片上的反應物可以用洗脫液洗脫, 從而使傳感片得到再生進行下一輪反應。所以SPR生物傳感器可重復使用多次。圖2：典型的感應圖。加入的分析物與結合在傳感片上的配體反應導致信號上升，記錄復合物的結合過程和平衡狀態(tài)。 當樣品加完后分析物被緩沖液代替, 此時信號的下降顯示了解析過程。 從結合的量可反映出樣品的濃度。BIA 技術相對于其他分子間相互作用技術的優(yōu)越性表現(xiàn)在:² 通過控制配體的偶聯(lián),來調(diào)節(jié)各種不同樣品, 不同目的的研究；² 無需任何標記(即無需同位素, 酶標或熒光物的標記)

11、， 表明了BIA 可適用于研究任何形式的相互作用, 甚至無需進行樣品的純化；² 在一個多聚物結合反應中, 每一步的相互作用都可分別記錄下來。從而為研究反應機理提供新的空間； ² 實時分析，記錄整個反應的結合與解析過程, 提供了反應的動態(tài)過程,測量周期短 這是其他技術無法比擬的。3.2 典型應用如今SPR生物傳感器已廣泛地用來分析生物分子相互作用的反應動力學、結合位點和反應物濃度等信息。對信號傳導、免疫調(diào)節(jié)、蛋白工程、抗體定性、基因調(diào)控、核酸研究、及藥物研制等方面的研究有很大的貢獻。SPR生物傳感器的一個主要應用領域是篩選和確認你感興趣分子的結合對象(如: 從雜交瘤細胞培養(yǎng)液

12、中鑒定單克隆抗體； 從天然物質(zhì)粗提液或組合的物質(zhì)文庫中篩選新藥物)。美國的Scheong-Plough制藥公司9利用SPR技術發(fā)展出簡便、決速、準確地篩選細胞因子桔抗物的方法。因為SPR生物傳感器可在無標記的條件下實時地測定分子間的結合反應, 所以很快就能從粗提液中將感興趣的生物分子鑒定出來。使用全自動型的SPR生物傳感器，如Biacore公司的BIAcore 1000 或BIAcore 2000，可連續(xù)分析多達192個樣品,節(jié)省大量的時間和勞力。如今已有不少生物制藥公司用BIA 技術來進行藥物篩選。10由于BIA 是一項實時分析技術,得到的傳感圖不僅可以看出結合反應,同時也記錄了整個反應的動

13、態(tài)信息，反應的強弱和快慢通?？蓮膫鞲袌D的曲線上看出。配以合理的實驗設計和數(shù)據(jù)分析方法,結合 BIA 技術，SPR生物傳感器可測定反應的動態(tài)參數(shù)及親和常數(shù), 并以此來論證提出的反應機理是否正確。生物分子相互作用實時分析儀配有一整套數(shù)據(jù)分析軟件來分析得到的數(shù)據(jù),從而提供反應的途徑和機理。 SPR生物傳感器可提供分子間相互作用的動態(tài)信息, 從而為生物分子的結構研究提供又一個極有價值的實驗方法。例如通過監(jiān)測蛋白質(zhì)中單個氨基的改變對此蛋白質(zhì)與其他分子結合功能的影響, 可探查出此蛋白質(zhì)的功能基團和其重要性。 因為分子間的相互作用可在免標記及非純化的條件下測定, 因此SPR傳感器非常適合于研究生物分子由于不

14、同的修飾而導致的功能變化。4. 結語如今，SPR傳感器已越來越受到學術界與工業(yè)界廣大科學研究人員的青睞。相對于一些傳統(tǒng)的方法, SPR傳感器不僅能省樣品而且能進行快速大量樣品分析或篩選，它的最大貢獻表現(xiàn)在能提供其他方法無法得到的信息, 研究并回答以前無法回答的問題。尤其是SPR生物傳感器的出現(xiàn)，加速了生命科學研究進展，使人們對復雜生命現(xiàn)象中的分子機理的理解更為深入并帶來越來越多的新發(fā)現(xiàn)。可以說，SPR傳感器就是解開復雜生命現(xiàn)象的鑰匙。我們有理由相信，在未來的日子里，SPR傳感器必有一個更為寬闊的發(fā)展前景。參考文獻1 Nylander C，Lieberg B，Lind T。Sensors and

15、 Actuators B，1982，3，79-882 Lieberg B, Nylander C, Lundstrom l. Sensors and Actuators B,1983,4，2093 趙曉軍，陳煥文，宋大千。表面等離子體子共振傳感器I：基本原理。分析儀器，2004年第四期4 Kazuyoshi Kurihara and Koji Suzuki. Theoretical Understanding of an Absorption-Based Surface Plasmon Resonance Sensor Based on Kretchmanns Theory. Anal. Ch

16、em.2002, 74,696-7015 Shigeru Toyama,Narumasa Doumae,Atsumu Shoji,Yoshihito Lkariyama. Design and fabrication of a waveguide-couple prism device for surface plasmon resonance sensor, Sensors and Actuators B ,65(2000)32-346 resonance sensors. Sensors and Actuators B, 50(2001)89-97 15sensitivity surface plasmon resonance s