重組人粒細胞集落刺激因子動員的骨髓基質(zhì)干細胞經(jīng)皮移植促進兔骨折愈合的實驗研究

1、重組人粒細胞集落刺激因子動員的骨髓基質(zhì)干細胞經(jīng)皮移植促進兔骨折愈合的實驗研究 10-08-24 11:18:00 編輯：studa20 作者：蔡建平， 張愛國，楊掌權(quán)【摘要】 目的探討重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)動員的骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)經(jīng)皮注射對兔橈骨骨折愈合的促進作用。方法對56只白兔施行骨折模型，隨機分為第1批(用藥組A組、空白對照組B組)和第2批(純化注射組C組、實驗對照組D組)。骨折模型術(shù)后14，28 d取材進行影像學(xué)、組織學(xué)、組織形態(tài)計量學(xué)檢測與分析。結(jié)果兩個批次的實驗組新生血管、骨小梁形成均明顯優(yōu)于同批對照組，4種骨痂記分、外骨痂厚度均高于對照組。結(jié)論通過r

2、hG-CSF動員的BMSCs經(jīng)皮注射后有明顯的促進骨折愈合作用。 【關(guān)鍵詞】 重組人粒細胞集落刺激因子; 骨髓基質(zhì)干細胞; 經(jīng)皮移植; 兔; 骨折愈合骨折延遲愈合或不愈合一直是骨科臨床十分關(guān)注的難題。由于自體骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs) 容易獲取，而且具有較強的增殖能力，自體BMSCs應(yīng)用于臨床不需要胚胎組織和應(yīng)用免疫抑制劑 1，因此許多學(xué)者研究提出自體骨髓經(jīng)皮移植是一種經(jīng)濟適用微創(chuàng)的治療方法。近年來隨著分子生物學(xué)、組織工程學(xué)的迅猛發(fā)展，骨髓基質(zhì)干細胞在不同的生長環(huán)境里可以向多種系的細胞分化，在此作者設(shè)想利用骨折斷端局部的微環(huán)境，局部增加骨髓基質(zhì)干

3、細胞質(zhì)量來加快骨折愈合的速度，促進肢體功能的早日恢復(fù)。期望對骨折愈合機制的研究以及骨折的臨床治療提供一種新的合乎生物學(xué)原則的思路。臨床和實驗研究均已證實粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)可以短期內(nèi)快速動員機體外周造血干細胞增殖和趨化到外周組織損傷處，可以對血液和心肌方面的疾患起到較好的治療作用。最近有研究報道G-CSF也可動員外周骨髓基質(zhì)干細胞快速增殖2，本研究在新西蘭大白兔骨折模型上皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating fa

4、ctor,rhG-CSF)，運用自體骨髓基質(zhì)干細胞體外純化和經(jīng)皮移植的手段，探討其對骨折愈合的影響?，F(xiàn)報道如下。1 材料與儀器1.1 動物健康成年長耳新西蘭大白兔，56只，雌雄不拘，體質(zhì)量3.24.1kg，46月齡，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所實驗動物中心。1.2 試劑與儀器rhG-CSF(山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，商品名：瑞白，產(chǎn)品批號：20080832);淋巴細胞分離液(Cedarlane 公司)。離心機(北京京立 LDZ5-2);凈化工作臺;光學(xué)顯微鏡;手術(shù)包及骨髓穿刺包;吸管;離心管。2 方法2.1 動物骨折模型的制備3所有實驗動物按體質(zhì)量劑量經(jīng)耳緣靜脈注射異戊巴比妥鈉(60 mg/k

5、g)麻醉，左前臂皮膚去毛，用碘酒、酒精常規(guī)消毒，局部作一切口，長約2 cm，剝離骨膜，于旋前圓肌止點遠端用雙鋸片造成橈骨中段3 mm寬的骨缺損，縫合傷口，不作任何固定，術(shù)后用慶大霉素4U肌注3 d預(yù)防感染。2.2 實驗分組與相關(guān)操作按隨機化原則將56只大白兔隨機分為2批。第1批兩組(用藥組A組、空白對照組B組)，每組14只，分籠喂養(yǎng)。模型制備成功1h后，A組家兔給予rhG-CSF 10g/kg皮下注射，1次/d，每天同一時間給藥，連續(xù)5 d;B組1次/d，連續(xù)5 d皮下注射相應(yīng)體積的生理鹽水。第2批兩組(純化注射組C組、實驗對照組D組)，同樣每組14只，分籠喂養(yǎng)。模型制備成功1h后，兩組家兔均

6、給予rhG-CSF 10g/kg皮下注射，1次/d，每天同一時間給藥，連續(xù)5 d。C組于第5天抽取骨髓，純化后注射于骨折部位;D組在骨折處注射相應(yīng)體積的生理鹽水。2.3 BMSCs的分離與純化4用異戊巴比妥鈉(60 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射對C組大白兔進行麻醉，無菌操作下，16號骨髓穿刺針從髂后上棘處穿刺，接10 ml注射器，抽取骨髓45 ml，將其注入含肝素200 u/ml的0.01MPBS中，1 500 r/min離心10 min，棄去脂肪和上清，用PBS重懸制成細胞懸液，小心加入至2倍體積的淋巴細胞分離液上層，室溫下以2 500 r/min離心25 min。用吸管吸取液面交界處云霧狀液

7、體，將其轉(zhuǎn)移至1 ml注射器內(nèi)。2.4 BMSCs的再植對C組大白兔，在原手術(shù)切口部位探查到骨缺損處，經(jīng)皮注入分離純化的BMSCs懸液，術(shù)后用慶大霉素4U肌注3 d預(yù)防感染。2.5 術(shù)后觀察及標本收集觀察切口局部反應(yīng)及愈合情況;所有動物于造模手術(shù)后第14天、28天分2批用空氣栓塞法處死，每組每批處死7只，動物處死后于肘腕部切斷取樣，先行X線攝片，隨后去除骨折周圍組織，以骨折處為中心鋸下一段1 cm長的橈骨，置于10%甲醛固定3 d后，鹽酸脫鈣、石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色。2.6 觀察指標及統(tǒng)計學(xué)處理4種骨痂計分法：每個標本鏡下所見4種骨痂(外骨痂、內(nèi)骨痂、橋梁骨痂、聯(lián)接骨痂)計分按：血腫1分，

8、纖維(成纖維細胞)2分，軟骨細胞和類骨質(zhì)組織3分，小梁骨4分。計算所得分相加為總分，再進行統(tǒng)計學(xué)秩和檢驗處理。外骨痂厚度測量：用目鏡測微尺計算每張切片中10個視野的外骨痂厚度求其平均數(shù)。再進行統(tǒng)計學(xué)t檢驗處理。2.7 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 X線片觀察結(jié)果術(shù)后第14天：A組、D組骨折線模糊，斷端已有少量纖維連接;C組骨皮質(zhì)連續(xù)，骨折斷端呈梭形,完全看不到骨折線;B組骨折線清晰可，見圖1。A-用藥組 B-空白對照組 C-骨髓純化注射組 D-實驗對照組圖1 術(shù)后第14天各組骨折端影像學(xué)比較術(shù)后第28天：A組、C組、D組骨折已完全愈合，可見