蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品制備

1、收稿日期:2006-04-22作者簡(jiǎn)介:張穎君(1977-,男,河北固安人,碩士,主要從事農(nóng)作物生物技術(shù)研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品制備張穎君1,高慧敏2,李輝1,劉茜1(11河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所,河北石家莊050031;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,河北石家莊050051摘要:蛋白質(zhì)組學(xué)是在后基因組時(shí)代出現(xiàn)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域,它是對(duì)機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能模式進(jìn)行研究。由于蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性,大大增加了我們研究的難度。本文綜述了蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備方法。關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)組;樣品制備中圖分類(lèi)號(hào):Q51文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1000-7091(2006增刊-0

2、007-04The Sample Preparation in Proteomics StudiesZHANG Y ing 2jun 1,G AO Hui 2min 2,LI Hui 1,LI U Qian 1(1.Institute of Cereal and Oil Crops ,Hebei Academy of Agriculture and F orestry Sciences ,Shijiazhuang050031,China ;2.Cash and Crops Institue of Agriculture ,HebeiAcademy of Agriculture and F or

3、estry Sciences ,Shijiazhuang050051,China Abstract :Proteomics is a new research field appeared in post genome era ,which studies all the protein expressions and function m odels of organism ,tissues or cells.Proteome is very com plex ,which make our research m ore difficult.The paper summarizes the

4、sam ple preparation in proteomics studies.K ey w ords :Proteome ;Sam ple preparation在人類(lèi)基因組計(jì)劃完成之后,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)人類(lèi)遺傳密碼的破譯并沒(méi)有像預(yù)測(cè)的那樣能夠揭開(kāi)人類(lèi)自身的終極奧秘,現(xiàn)在獲得的基因組知識(shí)還不能告訴我們基因組是如何決定一個(gè)人的個(gè)體特征以及它們編碼的蛋白質(zhì)到底在人體內(nèi)起什么樣的作用和如何起作用1,這些問(wèn)題只有依賴(lài)于蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究才能給出最終的答案。蛋白質(zhì)組(Pro 2teome 這一概念是澳大利亞學(xué)者Wilkins 和Williams 等人2于1994年提出的。隨著蛋白質(zhì)組的提出,蛋白質(zhì)組

5、學(xué)(Proteomics 3也自然而然地孕育產(chǎn)生。一般認(rèn)為它是研究特定時(shí)間或特定條件下這些蛋白質(zhì)表達(dá)情況的科學(xué)4,是在整體水平上研究蛋白質(zhì)組成與調(diào)控規(guī)律的科學(xué)5。由于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的復(fù)雜性,大大增加了蛋白質(zhì)樣品制備的難度。蛋白質(zhì)的表達(dá)具有時(shí)間和空間的特殊性,由于mRNA 的自身剪切、拼接、翻譯修飾和翻譯后修飾的大量存在,使其翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的數(shù)量可能是基因數(shù)量的數(shù)十倍,甚至百倍以上6。如簡(jiǎn)單的真核生物酵母為例,其基因組編碼蛋白質(zhì)為6145個(gè)7,人類(lèi)基因組約含2800040000個(gè)編碼基因8,其表達(dá)的蛋白質(zhì)可能達(dá)十幾萬(wàn)。而且蛋白質(zhì)在不同的細(xì)胞、組織、器官、體液中以及不同時(shí)段的表達(dá)千差萬(wàn)別,且動(dòng)態(tài)

6、范圍寬9。1蛋白質(zhì)樣品制備的基本原則樣品制備是蛋白質(zhì)組研究的第1步,它直接影響后期的研究結(jié)果。樣品來(lái)源不同,制備方法也會(huì)有所不同,但都需遵循以下幾個(gè)基本原則10:盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理,以避免蛋白丟失;細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解;盡可能地提高樣品的溶解度,并保持在整個(gè)電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)的溶解狀態(tài); 防止溶液介質(zhì)中對(duì)蛋白質(zhì)的華北農(nóng)學(xué)報(bào)2006,21(增刊:7210人為修飾;破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子之間的相互作用,以產(chǎn)生獨(dú)立的多肽鏈;有的研究中必須保持蛋白質(zhì)的活性;去除非蛋白雜質(zhì)。2樣品的分級(jí)處理如果組織中只有一類(lèi)蛋白質(zhì)是有意義的,那么在樣品制備過(guò)程中進(jìn)行分級(jí)分離則是必需的

7、。樣品分級(jí)主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級(jí)的。樣品分級(jí)不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)率,還可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。如對(duì)那些定位于細(xì)胞核、線粒體或高爾基體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì),我們可以應(yīng)用超速離心的方法富集;對(duì)那疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)我們通常采用分級(jí)提取的方法11。還有對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行研究時(shí),臨床樣本往往是各種細(xì)胞或組織混雜,而且狀態(tài)不一。如腫瘤組織中,發(fā)生癌變的往往是上皮類(lèi)細(xì)胞,而這類(lèi)細(xì)胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。為了解決這個(gè)問(wèn)題,一種稱(chēng)為激光捕獲微解剖(Laser Capture Microdissection, LC M的技術(shù)被應(yīng)用于

8、分離癌變上皮類(lèi)細(xì)胞,取得了很好的效果12。3適宜的選擇樣品制備方法3.1根據(jù)研究的不同目的選擇制備方法當(dāng)進(jìn)行樣品制備時(shí),很重要的一點(diǎn)是明確其研究目的。研究目的是獲得盡可能多的蛋白,還是僅獲得所感興趣的某些蛋白;是要求全蛋白表達(dá)譜還是可重復(fù)的清晰圖譜;是需要讓蛋白變性后進(jìn)行二維電泳還是需要蛋白質(zhì)保持活性。目的不同,提取液的成分就不同,如更注重保持蛋白質(zhì)的活性,則需用P BS或T ris2HCl等緩沖液;而要進(jìn)行二維電泳時(shí),提取液往往是由強(qiáng)變性劑等成分構(gòu)成的。3.2根據(jù)蛋白質(zhì)的不同特性選擇制備方法由于蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多,不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異,其溶解度也各不相同。根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性,同時(shí)可

9、選擇不同的溶劑提取。3.3不同組織蛋白質(zhì)的提取方法外在膜蛋白為水溶性蛋白,靠離子鍵或其他較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合,因此外在膜蛋白的提取較容易,只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來(lái),膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。而內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密,且水溶性不好,使用分級(jí)抽提方法獲得的膜蛋白中只有很少一部分是具備多跨膜區(qū)的整和膜蛋白,一般講只有用去污劑(Detergent使膜解后才可分離出來(lái)。膜蛋白的提取方法一般為: 其非極性尾可插于脂膜而結(jié)合高8華北農(nóng)學(xué)報(bào)21卷分子量蛋白質(zhì)而極性頭部為強(qiáng)陰離子性使S DS2蛋白質(zhì)復(fù)合物呈高水溶性13。并且,在設(shè)計(jì)膜蛋白溶解方案時(shí),還必須考慮某一去

10、污劑的特殊性質(zhì),如triton X2100在280nm處有吸收,如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm處的吸收有關(guān),就應(yīng)避免使用這類(lèi)去污劑。4蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)現(xiàn)在被廣泛用于蛋白標(biāo)本的預(yù)處理純化,它可以除去樣品中的鹽離子、小分子、離子去污劑、核酸、多糖、脂類(lèi)和酚類(lèi)雜質(zhì),可以富集低濃度蛋白質(zhì)。如果蛋白聚集和雜質(zhì)難以去除,則沉淀清除步驟是必需的。常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有硫酸銨沉淀(鹽析、T C A沉淀(三氯醋酸沉淀、丙酮沉淀法等。參考文獻(xiàn):1Venter J C,Adams M D,Myers E W,et al.The Sequenceof the Human G enomeJ.Science,2

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