堿性成纖維細(xì)胞生長因子在低氧大鼠肺動脈的表達(dá)及其對肺動脈張力的影響

1、    堿性成纖維細(xì)胞生長因子在低氧大鼠肺動脈的 表達(dá)及其對肺動脈張力的影響        摘要目的：觀察堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）在低氧性肺動脈高壓發(fā)病中的可能作用。方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)觀察低氧大鼠肺動脈bFGF的表達(dá)水平，并觀察bFGF對離體大鼠肺動脈環(huán)收縮功能的影響。結(jié)果：低氧時，肺動脈bFGF mRNA表達(dá)明顯增加，bFGF與-actin的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的放射強(qiáng)度（counts*min-150 為2.62×

2、10-7mol/L。結(jié)論：提示bFGF可能參與低氧性肺動脈高壓的發(fā)病過程。主題詞成纖維細(xì)胞生長因子，堿性；肺動脈；大鼠；低氧中分類號R543.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-4718(2000)06-0549-03 Expression of bFGF mRNA in pulmonary artery of rat with chronic hypoxia and its effect on tension of rat pulmonary artery in vitroRAN Pi-xin, CHEN Shun-cun(Guangzhou Institute of Respiratory D

3、isease, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, China)NIE Sheng-li(The Second Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)CHEN Yan-fang(Guangdong Provincial Hospital)AbstractAIM: To explore the role of basic-fibroblast growth factor (bFGF) in the development of pulmonary hyp

4、ertension induced by hypoxia. METHODS: 1) The pulmonary arteries of SD rats with hypoxia for one and two weeks were isolated, from which the total RNA were extracted by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorform .Then the levels of mRNA were measured by RT-PCR. 2) About 3mm-long arterial rings cu

5、t from SD rat pulmonary arterial stem were suspended between stainless steelhooks in chamber with warmed (37) Kreb's solution. Different concentrations of bFGF were added in a cumulative fashion into the chamber where the rings were suspended. The cumulative concentration response curve was obta

6、ined. RESULTS: 1)The levels of bFGF mRNA in pulmonary artery of rats with hypoxia were increased significantly compared with those that without hypoxia (2578±384 counts*min-1 (control) vs 5303±756 (hypoxia) for 1 week and 4054±547 (hypoxia) for 2 weeks, P all 0.05). 2) bFGF at concent

7、rations ranged from 5.56×10-102.78×10-7mol/L caused dose-dependent contraction of vessel rings of rat pulmonary artery (r=0.695,P0.05), with EC50 being 2.62×10-7mol/L. CONCLUSION: bFGF may play an important role in the hypoxic pulmonary hypertension.MeSHFibroblast growth factor, basic

8、; Pulmonary artery; Rats; Anoxia肺小動脈結(jié)構(gòu)改建是慢性低氧性肺動脈高壓的主要病理特征。一些生長因子和癌基因可能與該改建過程相關(guān)1，2。 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic-fibroblast growth factor, bFGF）作為主要的促血管生長因子之一，其能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的增生3，我們以前用免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)低氧兩周時，肺血管壁bFGF的陽性染色顆粒明顯多于對照組，故推測bFGF也可能參與肺血管的改建過程4 。本實驗用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)進(jìn)一步觀察低氧對大鼠肺動脈壁表達(dá)bFGF mRNA的影響，同時觀察bFGF對肺血管收

9、縮的作用，以探討它在低氧性肺血管收縮過程中的作用。材料和方法一、大鼠肺動脈壁bFGF檢測（一）動物來源及低氧方法體重250300 g雄性SD 大鼠30只（廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)用實驗動物廠提供），隨機(jī)分成對照組，低氧1周組和低氧2周組，每組各10只。低氧大鼠置于自制常壓低氧箱內(nèi)，調(diào)節(jié)箱內(nèi)氧濃度為10%，每天低氧8 h，對照組除不給低氧外，其它飼養(yǎng)條件與低氧組相同。（二）標(biāo)本取材及處理處死動物開胸取出心肺，小心分離肺動脈，立即置液氮內(nèi)凍存待用。實驗用所有器皿均在泡酸沖洗后于180干烤8 h以上或以DEPC水在37處理12 h，再高溫高壓消毒。（三）細(xì)胞總RNA提取按文獻(xiàn)報道之異硫氰酸胍法提取肺動脈壁總R

10、NA5 。（四）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用美國promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按盒內(nèi)說明書操作：在4按下列順序取各試劑加入滅菌的EP管中：25 mmol/L MgCl2 4 L 、10×緩沖液2 L,10 mmol/L dNTP混合物2 L、RNase抑制劑20 L、15-寡聚胸腺嘧啶核苷酸0.1 g 、禽源反轉(zhuǎn)錄酶20 U、總RNA 4 L，加水至總體積20 L，于42水浴60 min，反轉(zhuǎn)錄完成后再95水浴中加熱10 min，滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)。(五) 定量PCR本實驗所用引物由上海細(xì)胞所合成。引物序列為：-actin：5-ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGC

11、TGCG-3；5-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3，由該對引物可擴(kuò)增出一長度為838bp的-actin片段。bFGF6：5-GTATGAAACGGCGGCTTCTT-3，5-TGAGTCAGCTCTTAGCAGAC-3，用這對引物擴(kuò)增出的bFGF片段長度為364 bp。-actin擴(kuò)增反應(yīng)步驟如下：在4時依次向無菌EP管中加入10×PCR緩沖液5 L，上、下游引物各1 L， Taq酶1.25 U，混合dNTP 2 L、逆轉(zhuǎn)錄混合產(chǎn)物4 L、 -32P dCTP0.1 Ci，加水至50 L。變性、退火與延伸條件分別為90 1 min 、50 1 min

12、 、70 1 min，共30個循環(huán)，最后72 延伸10 min 后4保存。bFGF的擴(kuò)增反應(yīng)步驟為：依次于無菌EP管中加入：10×PCR緩沖液5 L，上、下游引物各1 L，dNTP混合物4 L，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 L，-32P dCTP 0.37×104 Bq，加水至50 L；反應(yīng)條件為變性94 1 min ，退火50 1 min ， 延伸70 1 min，共30個循環(huán)，最后72延伸10 min，4保存。反應(yīng)完畢取10 L 擴(kuò)增產(chǎn)物行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下切取含有PCR產(chǎn)物的凝膠條帶，用液體閃爍計數(shù)儀檢測擴(kuò)增物中32P的放射強(qiáng)度（counts*min-1）。二、大鼠肺

13、動脈環(huán)離體收縮實驗（一） 主要儀器與試劑bFGF為Sigma公司產(chǎn)品，Kreb氏液購自市售商店。八道生理記錄儀為日本光電公司產(chǎn)品。（二） 實驗動物與標(biāo)本制備斷頭處死體重300350 g 的雄性SD大鼠，制成長約3 mm 的血管環(huán)，置入盛37 Kreb氏液的浴槽內(nèi)，能通入95%O2-5% CO2 混合氣體，平衡備用。（三）肺血管收縮反應(yīng)讓血管環(huán)在最佳靜息張力800 mg下穩(wěn)定1 h，其間每隔15 min更換1次新鮮Kreb氏液，以張力傳感器、八道生理記錄儀等記錄血管環(huán)的張力。按累積法給予bFGF，先從閾濃度開始，待出現(xiàn)收縮平臺后，又給予既定劑量的bFGF，記錄血管環(huán)張力變化。結(jié)果一、低氧大鼠肺動

14、脈bFGF的表達(dá)低氧時SD大鼠肺動脈壁bFGF mRNA表達(dá)明顯高于對照組，表1。表1大鼠肺動脈RT-PCR產(chǎn)物放射性強(qiáng)度Tab 1 The radio-strength of RT-PCR product of ratpulmonary artery (±s,n=10）Group bFGF (counts.min-1)-actin (counts.min-1)bFGF/-actin (%)Control 2578±384 5081±287 50.74Hypoxia 1 week5303±756*5375±253 91.82*Hypoxia 2

15、 weeks 4054±547*5197±207 78.12* *P0.05， vs control 二、bFGF對大鼠肺動脈的收縮作用bFGF能引起大鼠離體肺動脈環(huán)的收縮，在濃度5.56×10-102.78×10-7mol/L時，其收縮強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)(r=0.695,P0.05),其EC50為2.62×10-7mol/L， 1。 Fig 1The effect of bFGF on tension of the pulmonary arterial rings of rat in vitro (n=5, r=0.695, P0.05)1b

16、FGF對離體大鼠肺血管環(huán)收縮功能的影響討論堿性成纖維細(xì)胞生長 因子（bFGF）刺激成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖的功能很強(qiáng)。成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等均可產(chǎn)生bFGF。我們以前用免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)，低氧大鼠肺組織內(nèi)bFGF陽性染色物質(zhì)明顯多于非低氧對照組4。本實驗用RT-PCR方法證實低氧可促進(jìn)大鼠肺動脈bFGF mRNA的表達(dá)增加，根據(jù)bFGF的致分裂特性，我們認(rèn)為它在低氧性肺血管結(jié)構(gòu)的重建中可能起一定作用。業(yè)已證明，低氧性肺動脈高壓的發(fā)病包含有兩個重要的發(fā)病環(huán)節(jié)，即低氧性肺血管收縮反應(yīng)和血管重建。除一系列生長因子直接刺激肺動脈細(xì)胞成分分裂增殖外，持續(xù)的血管收縮也可引起血

17、管壁的適應(yīng)性增殖。因此，本實驗還觀察了bFGF對肺血管收縮功能的作用，發(fā)現(xiàn)bFGF能收縮大鼠離體肺動脈環(huán)。提示bFGF可能參與低氧性肺動脈高壓發(fā)病的兩個環(huán)節(jié)。基金項目 廣州市計委重大攻關(guān)項目(編號951030)冉丕鑫（廣州醫(yī)學(xué)院附一院廣州呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510182）聶勝利（中山醫(yī)科大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院）陳顏芳（廣東省人民醫(yī)院心研所）陳順存（廣州醫(yī)學(xué)院附一院廣州呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510182）參考文獻(xiàn)1冉丕鑫，鐘南山. 生長因子、原癌基因與低氧性肺動脈高壓J. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1996，16（1）：15. 2Demiryurek AT, Wadsworth RM, Kane

18、 KA, et al. The role of endothelium in hypoxic constriction of human pulmonary artery ringsJ. Am Res Respir Dis, 1993,147:283287. 3Slavin I. Fibroblast growth factors: At the heart of angiogenesisJ. Cell Biol Int, 1995,19:431435. 4歐陽能太，冉丕鑫，杜志強(qiáng)，等. 缺氧對大鼠肺組織成纖維細(xì)胞生長因子和c-myc癌基因表達(dá)的影響J. 中華結(jié)核和呼吸雜志，1997，20（1）：2224. 5Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidin