喉鱗狀細(xì)胞癌DNA含量的FCM定量分析

1、    喉鱗狀細(xì)胞癌DNA含量的FCM定量分析        內(nèi)容提要選擇24例未經(jīng)治療的喉鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后新鮮腫瘤標(biāo)本,通過流式細(xì)胞儀(FCM)測定DNA含量的3個(gè)主要參數(shù),異倍體(aneuploid)、DNA指數(shù)(DNA Index,DI)和S期細(xì)胞比例(S-phase fraction,SPF),探索3個(gè)參數(shù)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。結(jié)果表明,24例喉鱗狀細(xì)胞癌中,異倍體檢出率為83.3%(2024)。DI與腫瘤組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān),與

2、腫瘤臨床分期有關(guān)(P0.05)。SPF與腫瘤組織學(xué)分級(jí)無關(guān),與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.01,P0.05)。提示:(1)DNA異倍體是喉鱗狀細(xì)胞癌的重要特征之一;(2)DI和SPF可作為預(yù)測喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)特性的重要指標(biāo)。關(guān)鍵詞喉腫瘤;流式細(xì)胞術(shù);DNA倍體;DNA指數(shù);S期細(xì)胞比例中國分類號(hào)R 739.65 THE QUANTITATIVE ANALYSIS OF DNA CONTENTSIN SQUAMOUS CARCINOMA OF LARYNX USING FCMYang QiuanZhao WeipingThe Affiliated Hospital of Shandong

3、Medical University,250012Qian ShaoJinan Women and Children Health HospitalAbstractFresh specimens from 24 previously untreated patients with squamous carcinomas of larynx(LSCC)were selected.Aneuploid,DNA index(DI)and S-phase fraction(SPF)were measured using flow cytometry(FCM).The association betwee

4、n these parameters with histologic grades,clinical stage and lymph node metastasis were studied.The results showed that the ratio of aneuploid was 83.3%(20/24).DI was not correlated with histologic grades and lymph node metastases,but correlated with clinical stages (P0.05).SPF was correlated both w

5、ith clinical stages(P0.01)and lymph node metastasis(P0.05).SPF had no relation with histologic grades.It is concluded that DNA aneuploid is one of the most important specialities in LSCC,meanwhile DI SPF can be regarded as significant predictors of biologic characteristics in LSCC.Key wordsLarynx ne

6、oplasms;Flow cytometry;DNA ploid;DNA index;S-phase fraction目前,臨床腫瘤學(xué)上預(yù)測惡性腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后仍主要根據(jù)其病理分級(jí)和臨床分期等指標(biāo),以腫瘤的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)特點(diǎn)為依據(jù),它在一定程度上反映了腫瘤的生物學(xué)特性。隨著對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)的不斷深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)單從形態(tài)學(xué)上反映腫瘤特性有局限性,并受主觀因素的影響,例如對(duì)良性腫瘤形態(tài)、惡性行為的腫瘤,對(duì)良、惡交界性腫瘤的診斷,會(huì)出現(xiàn)難以確定的情況;此外,腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為僅能部分從形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出來。臨床上需要尋求能更準(zhǔn)確反映腫瘤生物學(xué)特性的指標(biāo)。對(duì)多數(shù)人類腫瘤進(jìn)行DNA含量測定的結(jié)果表明

7、,DNA含量與惡性腫瘤的生物學(xué)特性、病理特征、預(yù)后等密切相關(guān)1。DNA含量高的腫瘤在分化、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后等方面常表現(xiàn)出較明顯的惡性生物學(xué)行為。我們使用流式細(xì)胞儀測定了喉鱗狀細(xì)胞癌DNA含量的3個(gè)主要參數(shù):異倍體,DNA指數(shù)(DI)和DNA增殖細(xì)胞百分比(SPF),分析了這些參數(shù)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系,以探討它們?cè)谂R床上的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)際意義。1材料與方法1.1臨床資料1997至1998年山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治喉鱗狀細(xì)胞癌24例,患者術(shù)前均未經(jīng)任何治療,取術(shù)后新鮮腫瘤標(biāo)本,送流式細(xì)胞儀檢查,并由本院病理科確定其病理類型和分化程度。喉癌24例均為鱗狀細(xì)胞癌;病理分

8、化程度是高分化6例,中分化6例,低分化12例,將高、中分化鱗癌并為1組,共12例。按1987年UICC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期,期2例,期4例,期10例,期8例,將、期合并為早期組,共6例,、期合并為晚期組,共18例,經(jīng)病理證實(shí)淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移組8例,非轉(zhuǎn)移組16例。24例中,男20例,女4例,男3772歲,平均57歲,女5060歲,平均59歲。1.23的新鮮組織塊,用機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液。用剪刀將組織塊剪至勻漿狀加入生理鹽水,低速離心2次(800r/min),去除細(xì)胞碎片,用200目尼龍網(wǎng)過濾,70%冰乙醇固定,放置04冰箱備檢;(2)DNA含量的檢測取出制備好的單細(xì)胞懸液,棄固定劑,用PBS洗

9、2次,調(diào)制106細(xì)胞數(shù)的單細(xì)胞懸液加入PI染色液1.0ml(內(nèi)含PI50g/ml,RNA酶50g/ml)30min后上機(jī)分析。選用正常人淋巴細(xì)胞作為正常二倍體DNA對(duì)照標(biāo)準(zhǔn),調(diào)節(jié)變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)5%;(3)結(jié)果判定流式細(xì)胞儀測得數(shù)值經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理,顯示細(xì)胞DNA含量直方。因單純從直方判斷,易受Go/G1峰出現(xiàn)的位置及G2/M峰比例的影響。為準(zhǔn)確判斷,依據(jù)定量指標(biāo)DNA指數(shù)(DI)判定2,DI=1.0±0.1為二倍體,DI=1.0±0.15為近二倍體,DI=2.0±0.1為四倍體,DI2.10為多倍體,余為非整倍體

10、。判定結(jié)果時(shí),將近二倍體、四倍體、多倍體和非整倍體均劃歸異倍體。流式細(xì)胞儀可同時(shí)測量腫瘤細(xì)胞S期比例(SPF),SPF=S/(G0G1）S（G1M）×100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法腫瘤細(xì)胞DNA異倍體與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系對(duì)比用2檢驗(yàn),DI和SPF與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系對(duì)比用t檢驗(yàn)。由于本研究樣本較少,2檢驗(yàn)用直接概率法計(jì)算P值,t檢驗(yàn)采用校正t檢驗(yàn)。P0.05為差異有顯著意義,P0.01為差異有高度顯著意義。2結(jié)果2.1DNA含量與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系見表1。表1DNA含量與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系組織學(xué)分級(jí)n異倍體二倍體DI(±s)SPF(

11、77;s)n%n%高中分化鱗癌低分化鱗癌121281266.671004033.331.27±0.26?1.35±0.1915.04±6.32?18.95±16.87?*P0.05 24例中,高中分化鱗癌12例,低分化鱗癌12例,異倍體分別為8例(66.67%)和12例(100%),異倍體率呈增高趨勢,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無顯著性。高中分化鱗癌的DI和SPF與低分化鱗癌的差異無顯著性(P0.05)。2.2DNA含量與臨床分期的關(guān)系見表2。表2DNA含量與臨床分期的關(guān)系臨床分期n異倍體二倍體DI(±s)SPF(±s)n%n%、期、期61841

12、666.6788.892233.3311.111.16±0.101.36±0.23?6.25±5.420.58±12.35?*P0.05*P0.01 24例中,早期腫瘤(、期)6例,晚期腫瘤(、期)18例,其異倍體分別為4例(66.67%)和16例(88.89%),異倍體率呈增高趨勢,但差異無顯著性(P0.05)。晚期腫瘤DI高于早期腫瘤,差異有顯著性(P0.05)。晚期腫瘤SPF高于早期腫瘤,差異有高度顯著性(P0.01)。2.3DNA含量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系見表3。表3DNA含量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系淋巴結(jié)n異倍體二倍體DI(±s)SPF(

13、77;s)n%n%非轉(zhuǎn)移組轉(zhuǎn)移組1681287510040251.30±0.241.33±0.2111.92±7.9827.15±14.50*P0.05 24例中頸部無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例,其異倍體分別為12例(75%)和8例(100%),異倍體率呈增高趨勢,但差異無顯著性(P0.05)。轉(zhuǎn)移組DI與非轉(zhuǎn)移組比較,差異無顯著性(P0.05),轉(zhuǎn)移組SPF高于非轉(zhuǎn)移組,差異有顯著性(P0.05)。3討論惡性腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因子、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程,腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)包括細(xì)胞的無休止和無序分裂增殖,并具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性,其基本變化是細(xì)胞DNA發(fā)

14、生變異,近年,腫瘤細(xì)胞DNA的研究和測定已成為熱點(diǎn)。3.1DNA含量測定概述1953年Watson和Crick闡明了DNA的分子結(jié)構(gòu),分子生物學(xué)時(shí)期從此開始。學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn),某些疾病的發(fā)病機(jī)理與DNA的變異有關(guān),并逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控的失調(diào),細(xì)胞DNA與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞DNA一般有以下特點(diǎn):(1)出現(xiàn)異倍體或多倍體,DNA異倍體是惡性腫瘤的重要標(biāo)志之一;(2)DNA含量多有不同程度的增高;(3)DNA合成期細(xì)胞比例增加,說明細(xì)胞增殖多。DNA含量測定與腫瘤形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合會(huì)進(jìn)一步提高人們對(duì)腫瘤惡性生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)水平。用流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)

15、新鮮腫瘤組織或石蠟包埋組織行DNA參數(shù)測定,但后者與前者相比,有以下不足:(1)樣品中的碎片較多,DNA組方質(zhì)量不及新鮮組織好,組方的細(xì)胞峰較寬,細(xì)胞峰CV值較大;(2)異倍體率減少,由于組方的細(xì)胞峰CV值增大,一些接近于二倍體的DNA異倍體峰位被掩蓋;(3)S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)不如新鮮組織的S期計(jì)算準(zhǔn)確;(4)DNA二倍體標(biāo)準(zhǔn)不穩(wěn)定。我們用新鮮腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液,通過流式細(xì)胞儀測得的數(shù)據(jù)可靠、準(zhǔn)確。3.2流式細(xì)胞儀在惡性腫瘤臨床實(shí)踐中的應(yīng)用通過流式細(xì)胞儀DNA分析,異倍體、腫瘤細(xì)胞增殖異常、SPF等指標(biāo)在許多常見的惡性腫瘤中,與腫瘤的重要生物學(xué)特性密切相關(guān),這些指標(biāo)與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)相

16、比有著獨(dú)立的特性,通過研究,證實(shí)它們?cè)谀承┠[瘤中可作為臨床腫瘤預(yù)測的重要指標(biāo)3。Tribukait等4用流式細(xì)胞儀對(duì)膀胱癌DNA含量進(jìn)行研究,回顧性或前瞻性研究均證實(shí)DNA倍體與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)。I級(jí)乳頭狀腫瘤多為二倍體,而級(jí)腫瘤、非乳頭狀腫瘤、侵襲性腫瘤多為異倍體,級(jí)腫瘤一半為二倍體,一半為異倍體。二倍體膀胱癌如果復(fù)發(fā),一般不發(fā)生外侵或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而異倍體膀胱癌復(fù)發(fā),易發(fā)生外侵和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。證實(shí)膀胱癌DNA倍體與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期所提示的腫瘤外侵和轉(zhuǎn)移特性相關(guān)。Auer等5最先對(duì)乳腺癌患者DNA倍體進(jìn)行回顧性研究,將患者分為4組,I組為二倍體腫瘤組,組為四倍體腫瘤組,

17、組為四倍體和二倍體混合組,組為多倍體腫瘤組,結(jié)果組患者10年生存率明顯高于組,而、組的生存率和腫瘤的惡性行為介于、組之間。Olszewski6研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌二倍體腫瘤的雌激素受體(ER)陽性率比異倍體腫瘤高,預(yù)后好于異倍體腫瘤,而在異倍體腫瘤中,高SPF與高復(fù)發(fā)率和高死亡率相關(guān),且SPF與腫瘤組織學(xué)分級(jí)也有很強(qiáng)的相關(guān)性,認(rèn)為在臨床實(shí)踐中,應(yīng)將異倍體和SPF做為重要參考指標(biāo)。3.3DNA含量與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系頭頸部鱗狀細(xì)胞癌DNA含量的流式細(xì)胞儀研究分析資料尚不多,以往的資料顯示,頭頸部鱗癌的異倍體發(fā)生率大約是57%86,平均66%。Stell7通過對(duì)頭頸鱗癌的分析,認(rèn)為其DNA含量與病

18、理分級(jí)密切相關(guān),高分化腫瘤組異倍體率為37%,低分化組則為64%,差異有高度顯著性。Costello8認(rèn)為,單純分析異倍體,、期頭頸鱗癌的異倍體檢出率高于、期患者,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異,進(jìn)一步分析DI,發(fā)現(xiàn)、各期腫瘤DNA指數(shù)之間,差異有顯著性,表明單純從倍體特性直接研究它與臨床分期之間的關(guān)系,有時(shí)不能反映其內(nèi)在聯(lián)系,只有進(jìn)一步研究DI與臨床分期的關(guān)系,才能揭示其內(nèi)在規(guī)律。Kokal9對(duì)76例頭頸鱗癌進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)分析,發(fā)現(xiàn)DNA倍體與頭頸鱗癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),認(rèn)為DNA倍體在預(yù)測復(fù)發(fā)率和生存率方面有重要的臨床意義,而且是預(yù)測手術(shù)切除腫瘤后患者生存率最重要的預(yù)后變量。近年通過流式細(xì)胞

19、儀測定頭頸鱗狀細(xì)胞癌DI和SPF發(fā)現(xiàn),DI和SPF能更準(zhǔn)確地反映頭頸鱗癌的生物學(xué)特點(diǎn)和惡性行為。John10通過對(duì)88例未行治療的喉鱗狀細(xì)胞癌分析,DI與其侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率和生存期有關(guān),他認(rèn)為,DI可作為獨(dú)立變量,對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后進(jìn)行估測,比傳統(tǒng)分期更有意義。Gomez11發(fā)現(xiàn)SPF與腫瘤的大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān),是最有力的腫瘤預(yù)測指標(biāo)之一。Johnson12分析了DI和SPF與頭頸鱗癌的關(guān)系,認(rèn)為DI和SPF與腫瘤的惡性程度、侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。我們利用流式細(xì)胞儀定量分析24例喉鱗狀細(xì)胞癌,其異倍體檢出率為83.3%(2024）,表明流式細(xì)胞儀對(duì)新鮮腫

20、瘤標(biāo)本DNA倍體檢出率較高。我們發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分化程度降低,臨床分期增高,淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí),異倍體率呈增高的趨勢,但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異,也可能與本研究樣本較小有關(guān)。本研究顯示,DI與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期有關(guān),晚期腫瘤組(、期)DI值高于早期腫瘤組(I、期)(P0.05),而DI與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。DI值高,則DNA倍體變異程度大,晚期腫瘤DNA異倍體或多倍體出現(xiàn)的比率高,DNA含量高,腫瘤惡性行為增強(qiáng)。本研究顯示,SPF與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。晚期腫瘤組(、期)SPF高于早期腫瘤組(I、期)(P0.01),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組SPF高于非轉(zhuǎn)移組(P0.05)。SPF與喉鱗狀細(xì)胞癌

21、組織學(xué)分級(jí)無關(guān)。SPF表示S期細(xì)胞增殖百分比,SPF高則S期細(xì)胞增殖活躍,腫瘤增殖活性增強(qiáng),DNA合成增加,腫瘤細(xì)胞無限制、無休止增殖的細(xì)胞數(shù)量不斷地增多,則惡性腫瘤外侵、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為強(qiáng)烈。綜上所述,可得出以下結(jié)論:(1)本組喉鱗狀細(xì)胞癌異倍體檢出率為83.3%,表明DNA異倍體是喉鱗狀細(xì)胞癌的重要特征之一;(2)本研究顯示DI與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期有關(guān)(P0.05)。SPF與其臨床分期有關(guān)(P0.01);SPF與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)。通過流式細(xì)胞儀對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行DNA定量測定,其DI、SPF可作為判斷喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)特性的重要指標(biāo)。作者單位：楊秋安趙維萍山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)

22、院,250012錢哨濟(jì)南婦幼保健院,250001參考文獻(xiàn)1Ciancio G,et al.Flow cytometric analysis of DNA and nuclear protein in paraffin-embedded tissue.Cytometry,1993;14:2052Merkel DE,et al.Ploidy,proliferative activity and prognosis,DNA flow cytometry of solid tumors.Cancer,1990;65:11943Mekel DE,et al.Flow cytometry,cellular

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