基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸工藝優(yōu)化

1、基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸工藝優(yōu)化時(shí)間：2005-5-17 10:56:24 作者：不詳 來源：中國(guó)發(fā)酵工業(yè)網(wǎng) 點(diǎn)擊數(shù)： 本站另注：L-苯丙氨酸已在國(guó)內(nèi)江蘇部分廠家有發(fā)酵工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，但仍然推薦此文供大家研究參考，了解工藝配方和分析方法。    L-苯丙氨酸(L-phe)是人和動(dòng)物體內(nèi)不能合成的8種氨基酸之一,人們稱其為必須氨基酸。L-phe在生物體內(nèi)是轉(zhuǎn)化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成為一些氨基酸輸液和氨基酸飲膳所必須的成分。而且,L-phe是合成藥物麥角胺、抗生物質(zhì)和維生素B6的重要原料。同時(shí),L-phe也是合成一些抗癌藥物的中間體1。在食品工業(yè)中

2、,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味劑,俗稱蛋白糖?；贚-phe廣泛的應(yīng)用前景,近年來L-phe成為氨基酸行業(yè)單品中產(chǎn)量增長(zhǎng)最快的一種。目前,L-phe的生產(chǎn)方法有酶法、發(fā)酵法等,直接發(fā)酵法具有可利用廉價(jià)原料直接生產(chǎn)L-phe的優(yōu)點(diǎn),發(fā)酵法生產(chǎn)L-phe,國(guó)外報(bào)道產(chǎn)酸率為2.8%,L-phe在我國(guó)還未實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)2。本實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建的重組L-phe基因工程菌E.coLiHB101. 進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),研究了其發(fā)酵工藝條件及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流加對(duì)產(chǎn)物L(fēng)-phe積累的影響。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1發(fā)酵用菌株基因重組工程菌E.coLiHB101. 。1.2培養(yǎng)基1.2.1種子培養(yǎng)基蛋白胨1%;氯化鈉1%;酵母粉

3、0.5%;葡萄糖2%;調(diào)pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamate0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖20g/L;Km40mg/L。1.2.3補(bǔ)料培養(yǎng)基CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。1.3培養(yǎng)方法1.3.1搖瓶培養(yǎng)250mL錐形瓶?jī)?nèi)裝LB培養(yǎng)基25mL,接種菌種斜面后,于旋轉(zhuǎn)搖床上,在37培養(yǎng)12h。1.3.2深層培養(yǎng)  

4、   在2L自控發(fā)酵罐(美國(guó)進(jìn)口)中裝入1L發(fā)酵培養(yǎng)基。滅菌后接入5%的搖瓶種子。通氣量為1000L/L·min時(shí),于38.5下攪拌培養(yǎng)。攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)溶氧(DO)調(diào)節(jié);使用28%的氨水調(diào)節(jié)pH=7.0±0.2;采用流加葡萄糖工藝補(bǔ)料,補(bǔ)料速率由測(cè)定葡萄糖來控制。1.4測(cè)定方法1.4.1菌體濃度     通過測(cè)定培養(yǎng)液或其稀釋液在波長(zhǎng)660nm處的吸光度OD660確定菌體濃度。一個(gè)OD660單位相當(dāng)于0.267g/L(菌體干重)。當(dāng)OD660<0.3時(shí),有良好的線性關(guān)系。1.4.2殘?zhí)菨舛?#160; 

5、;  用費(fèi)林試劑法測(cè)定3。1.4.3發(fā)酵液中L-phe濃度分析    用熒光法進(jìn)行測(cè)定4。2結(jié)果與討論2.1生長(zhǎng)因子對(duì)苯丙氨酸積累的影響    通過添加不同濃度的酪氨酸,實(shí)驗(yàn)由圖1示出:隨著酪氨酸添加量的增加,產(chǎn)酸率提高,從發(fā)酵成本和產(chǎn)酸率兩方面分析,得出酪氨酸的最適添加量為1.01.2g/L,既可得高產(chǎn)酸率3.68%,又可使成本不致過高。2.2工藝與代謝副產(chǎn)物乙酸對(duì)苯丙氨酸的影響     通過對(duì)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)得出:當(dāng)發(fā)酵溫度控制在3839,溶解氧(DO)控制在20%,在整個(gè)實(shí)

6、驗(yàn)過程中葡萄糖濃度維持在1.5%,既有利于苯丙氨酸的積累,又能有效抑制乙酸的產(chǎn)生,苯丙氨酸的濃度可達(dá)到3.86%,結(jié)果見圖2。3結(jié)論   1)獲得了L-phe發(fā)酵的優(yōu)化工藝參數(shù)為:攪拌轉(zhuǎn)速450r/min,發(fā)酵溫度為38.5,DO控制在20%,發(fā)酵液pH值為7.0,糖濃度控制在1.5%,酪氨酸添加量為1.01.2g/L。另外,分析了上述工藝條件對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)和L-phe積累的影響。   2)溶氧控制的葡萄糖流加補(bǔ)料和酪氨酸分批補(bǔ)料雙重調(diào)控可以有效地控制菌體比生長(zhǎng)速度,減少乙酸產(chǎn)生,提高菌體濃度和L-phe濃度。   3)經(jīng)十幾批發(fā)酵條件的摸索和5批穩(wěn)定發(fā)酵,該菌種重組質(zhì)粒穩(wěn)定,重復(fù)性好,平均產(chǎn)酸量36.8g/L。參考文獻(xiàn):1林銳.l-苯丙氨酸研究現(xiàn)狀J.微生物通訊,1992,26(2):15-18.2范代娣,李萬華,張小燕,等.732H+離子樹脂在l-苯丙氨酸發(fā)酵純化中的應(yīng)用J.西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版