高效液相色譜法測定川芎不同炮制品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量

1、高效液相色譜法測定川芎不同炮制品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量                          作者：夏荃，文惠玲，李土光 賀潔兒【摘要】  【目的】測定并比較川芎不同炮制品中游離阿魏酸、總阿魏酸的含量?！痉椒ā坎捎贸曁崛》?，以甲醇甲酸(955,V/V)為游離阿魏酸的提取溶劑，以甲醇20 g/L NaHCO3(955,V

2、/V)為總阿魏酸的提取溶劑;采用高效液相色譜(HPLC)法測定，色譜條件為：Diamonsil C18分析柱(250 mm×4?6 mm，5 m);流動相為乙腈體積分數(shù)1%冰醋酸(2080,V/V);檢測波長：320 nm;流速:1?0 mL/min;柱溫：室溫?！窘Y(jié)果】酒炙川芎的游離阿魏酸和總阿魏酸含量均高于生品及制川芎。川芎生品與不同制品水煎液中阿魏酸含量均高于其游離阿魏酸含量?！窘Y(jié)論】本研究含量測定方法簡便、準確，可用于川芎及其炮制品中阿魏酸含量的測定研究;測定川芎中總阿魏酸的含量更能反映川芎的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】  川芎/生產(chǎn)與制備;川芎/化學;阿魏酸/分析;色譜法，

3、高壓液相川芎為傘形科多年生草本川芎Ligusticum chuanxiong Hort?鋇母?莖1，具有行氣活血、祛風止痛之功效，臨床上有生川芎、酒炙川芎以及制川芎(廣東習用)等多個炮制品種。川芎中含有內(nèi)酯類、生物堿、有機酸類或酚類以及中性油類等多種有效成分2，其中阿魏酸具有較強的生理活性，具有抑制血小板聚集、解除血管平滑肌痙攣、抗氧化和提高膜穩(wěn)定性以及抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用3-4。在川芎的質(zhì)量控制研究中，以阿魏酸的定量分析較多，采用了不同的提取溶劑及提取方法，所測得阿魏酸的含量從0?49 mg/g至2?14 mg/g不等5-8。有文獻報道9，當歸中的阿魏酸松柏酯，因提取工藝不同可

4、以在一定條件下水解為阿魏酸，故提出了游離阿魏酸和總阿魏酸的概念，前者為藥材中的阿魏酸，而后者為游離阿魏酸及其衍生物水解所得阿魏酸之和，因此僅測定游離阿魏酸不足以反映藥材的質(zhì)量。川芎中亦含有阿魏酸松柏酯，本實驗測定并比較了川芎不同炮制品中游離阿魏酸、總阿魏酸的含量，并對川芎不同炮制品水煎液中的阿魏酸含量進行了測定，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1?1主要儀器與試劑天美高效液相色譜儀(包括HITACHI LC2130泵、L2200自動進樣器、LC2030紫外檢測器、T2000P工作站);CQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);試驗所用水為超純水，乙腈為色譜純，其他所用試劑均為分析純。1?2

5、藥物川芎藥材購自廣州市大翔藥材有限公司，經(jīng)過廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李薇教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort?鋇母?莖;阿魏酸對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110773?200611。1?3藥物制備取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，悶潤，切薄片，低溫烘干，篩去碎屑，制備生川芎飲片10;取生川芎片，按質(zhì)量比101加入黃酒拌勻，稍悶潤，待酒被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至棕黃色時，取出晾涼，篩去碎屑，制備酒炙川芎飲片10;取凈川芎，用水浸3 h，撈起，瀝干水，按質(zhì)量比101加入黃酒拌勻，待酒被吸盡后，蒸3 h至透心，取出，放冷，切薄片，

6、低溫烘干，篩去碎屑，制備制川芎飲片11。1?4提取溶劑的確定采用超聲提取方法，選取了甲醇，甲醇水(955,V/V)，甲醇甲酸(955,V/V)，甲醇?20 g/L NaHCO3(955,V/V)等提取溶劑進行比較，采用高效液相色譜(HPLC)法，色譜條件為A：體積分數(shù)0?1%冰醋酸水溶液,B:乙腈;梯度洗脫：體積分數(shù)19%B 018 min，18%60%B 1860 min;檢測波長：320 nm;流速:1?0 mL/min;柱溫:30 ;進樣量:10 L，觀察HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)阿魏酸的含量發(fā)生規(guī)律性的變化，在用甲醇?20 g/L NaHCO3為溶劑提取時，阿魏酸峰(A峰)面積增大，而B峰(根

7、據(jù)文獻9推測可能為阿魏酸松柏酯峰)幾乎消失;以甲醇甲酸為溶劑提取時，A峰面積最小，B/ A峰面積比最大(圖1)。按照文獻9方法測定游離阿魏酸以盡量保留B峰，測定總阿魏酸則以B峰消失，A 峰明顯增大為標準。故選用甲醇甲酸作為提取川芎藥材游離阿魏酸的溶劑，以甲醇20 g/L NaHCO3為提取總阿魏酸的溶劑。1?奔狀肌?20 g/L NaHCO3;2?奔狀肌?水;3?奔狀?;4?奔狀肌?甲酸1?5提取時間的確定以甲醇甲酸及甲醇20 g/L NaHCO3為提取溶劑，對20、40、60、100 min等超聲時間進行考察， 60 min后阿魏酸峰面積均不再明顯變化，故選擇60 min作為超聲提取時間。1

8、?6對照品溶液的制備稱取阿魏酸對照品適量，精密稱定，先用少量甲醇全部溶解標準品，再以甲酸水溶液(595,V/V)定容至刻度，制得濃度為232?4 g/mL的對照品儲備液，備用。1?7供試品溶液的制備1?7?1游離阿魏酸樣品制備取約0?5 g藥材粉末(過20目篩)，精密稱定質(zhì)量，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇甲酸溶液，稱定質(zhì)量，超聲60 min，放冷，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0?45 m微孔濾膜，收取續(xù)濾液作為供試品溶液。1?7?2總阿魏酸樣品制備取約0?5 g藥材粉末(過20目篩)，精密稱定質(zhì)量，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇20 g/L NaHCO3溶液，稱定質(zhì)量，

9、超聲60 min，放冷，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0?45 m微孔濾膜，收取續(xù)濾液作為供試品溶液。1?7?3水煎液樣品制備取約0?5 g藥材粉末(過20目篩)，精密稱定質(zhì)量，精密加入25 mL蒸餾水，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，回流1 h，放冷，用蒸餾水補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0?45 m微孔濾膜，收取續(xù)濾液作為供試品溶液。1?8色譜條件美國迪馬公司Diamonsil C18分析柱(250 mm×4?6 mm，5 m);流動相為乙腈體積分數(shù)1%冰醋酸(2080,V/V);檢測波長：320 nm;流速：1?0 mL/min;柱溫：室溫。進樣量：10 L。色譜圖見圖2。百事通2結(jié)

10、果2?1線性關(guān)系考察精密量取阿魏酸對照品儲備液適量，置10 mL棕色量瓶中，加甲酸水溶液(595,V/V)定容至刻度，搖勻，配制成濃度為2?324、4?648、11?620、 23?240、46?480 g/mL的對照品溶液，分別取上述溶液各10 L注入液相色譜儀，按1?8項下色譜條件測定峰面積。以各對照品進樣量(X/g)對峰面積(Y/mAu)進行線性回歸，得到標準方程：Y= 5132092?09 X+15 233?67 (r=0?999 9)，線性范圍0?023 240?46 48 g。2?2精密度試驗取同一對照品溶液，按1?8項下色譜條件連續(xù)進樣5次，測定阿魏酸峰面積sR為1?35%，表明

11、儀器精密度良好。2?3重復性試驗取川芎生品，按1?7項下供試品溶液的制備方法分別制備5份供試品溶液，按1?8項下色譜條件測定游離阿魏酸平均含量為0?364 mg/g，sR為2?98%;總阿魏酸平均含量為1?03 mg/g，sR為2?38%。本方法重現(xiàn)性良好。2009年第26卷廣州中醫(yī)藥大學學報2?4穩(wěn)定性實驗取同一供試品，按1?7項下供試品溶液的制備方法分別制備游離阿魏酸供試品溶液及總阿魏酸供試品溶液，并分別在0、5、10、15、20、24 h進樣1次，按1?8項下色譜條件測定峰面積，阿魏酸峰面積sR分別為1?15%、1?68%，表明供試品24 h內(nèi)穩(wěn)定。2?5回收率試驗精密稱取6份已知含量的

12、供試品各約0?25 g，每份添加對照品適量，按1?7項下供試品溶液的制備方法處理，1?8項下色譜條件測得游離阿魏酸及總阿魏酸含量，并計算回收率。結(jié)果見表1、表2。2?6樣品含量測定精密吸取供試品溶液10 L，注入高效液相色譜儀，按1?8項下色譜條件測定游離阿魏酸和總阿魏酸峰面積，計算含量，結(jié)果見表3、表4、表5。表1游離阿魏酸加樣回收率試驗結(jié)果表2總阿魏酸加樣回收率試驗結(jié)果表3川芎生品及不同炮制品中游離阿魏酸含量測定表4川芎生品及不同炮制品中總阿魏酸含量測定表5川芎生品及不同炮制品水煎液中阿魏酸含量測定3討論川芎中含有阿魏酸和阿魏酸松柏酯，其中阿魏酸松柏酯在中性、強酸或堿性條件下可以水解生成阿

13、魏酸，即使水浴加熱都可能不同程度地發(fā)生，但弱有機酸可以抑制水解過程9。本實驗結(jié)果表明甲醇甲酸溶液能較好地抑制阿魏酸松柏酯的水解，而在甲醇20 g/L NaHCO3中則幾乎全部水解，結(jié)果與文獻報道一致9。炮制加工可以引起川芎中阿魏酸含量的變化，其中游離阿魏酸的含量：酒炙川芎廣東制川芎生川芎;總阿魏酸的含量：酒炙川芎生川芎廣東制川芎。按照全國炮制規(guī)范所制的酒炙川芎游離阿魏酸及總阿魏酸含量均高于生品，可能與酒炙過程可增加阿魏酸的溶出有關(guān)。由于廣東地區(qū)習用的制川芎為蒸制所得，在炮制過程中阿魏酸和阿魏酸松柏酯都可能發(fā)生水解等變化，導致阿魏酸含量的下降。但與生川芎與酒炙川芎相比，制川芎有更濃郁的香氣，是否

14、還伴隨揮發(fā)油等其他成分的變化，尚需進一步研究。川芎生品及不同炮制品水煎液中阿魏酸的含量：酒炙川芎生川芎廣東制川芎，且均高于以甲醇甲酸為提取溶劑測得的游離阿魏酸的含量，說明在水煎煮的過程中，已存在阿魏酸松柏酯的水解，故僅測定川芎中游離阿魏酸的含量不足以反映藥材的質(zhì)量。另外，在許多文獻中，川芎中阿魏酸的測定結(jié)果有較大偏差，很可能為未考慮到有水解反應的發(fā)生，對提取溶劑未做進一步研究的結(jié)果?！緟⒖嘉墨I】  1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典S.北京：化學工業(yè)出版社，2005:28.2 陰健，郭力弓.中藥現(xiàn)代化研究與臨床應用M.北京：學苑出版社，1993:108.3 楊奎,周明眉,姜遠平,

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