反義端粒酶RNA對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞系的作用

1、反義端粒酶RNA對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞系的作用摘要目的觀察反義端粒酶RNA對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞系的作用，探討抗端粒酶治療在原發(fā)性肝癌治療中的意義。方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將潮霉素抗性的反義端粒酶RNA真核表達(dá)載體PBBS212/hTR轉(zhuǎn)入SMMC7721肝癌細(xì)胞中，經(jīng)潮霉素篩選，克隆細(xì)胞株擴(kuò)增鑒定后，采用TRAP-PCR-ELISA及FCM、電鏡檢測(cè)反義端粒酶RNA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果TRAP-PCR-ELISA法檢細(xì)胞端粒酶活性的檢測(cè)結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)組吸光度值為0.482，對(duì)照組吸光度值為2.861；FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)組13.8%，對(duì)照

2、組未見(jiàn)有凋亡峰形成，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞具有典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞發(fā)生較多的凋亡。結(jié)果表明反義端粒酶RNA顯著抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞的端粒酶活性，并且對(duì)其有顯著的促凋亡作用。結(jié)論反義端粒酶RNA能有效地抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，同時(shí)顯著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。借助抑制細(xì)胞端粒酶活性的手段來(lái)達(dá)到阻止腫瘤生長(zhǎng)的目的，為肝癌的治療提供了新的途徑。關(guān)鍵詞端粒酶；反義核酸；肝腫瘤；基因轉(zhuǎn)染；細(xì)胞凋亡中分類(lèi)號(hào)R735.7；R730.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1005-8664(2000)05-01-03 The effect of anitsense telomerase RN

3、A on SMMC7721ZHANG Chuan-shan WANG Wen-liang, Liu Li,et al.(Fourth Military Medical University,Xian 710033)AbstractObjectiveTo observe the effect of antisense telomerase RNA on SMMC7721 hepatocarcinoma cell line and to investigate the significance of antitelomerase therapy for treatment of primary h

4、epatocarcinoma.MethodsAntihygromycin antisense RNA eucaryotic expression vector,PBBS212/hTH,was introduced into SMMC7721 hepatocarcinoma cells by using lipofection medication.After hygromycin screening and cloning TRAP-PCR-ELISA and FCM were used to observe effects of PBBS212/hTH on telomerase activ

5、ity and cell apoptosis.ResultsTRAP-PCR-ELISA showed that experimental group registered 0.482 and control group 2.861 in telomerase activity;FCM showed that experimental group registered 13.8% in apoptosis,suggesting antisense telomerase RNA has a significant inhibition of SMMC7721 telomerase activit

6、y and a marked promotion of the cells apoptosis.ConclusionsInhibition of hepatocarcinoma telomerase activity and promotion of carcinoma cells apoptosis through antisense telomerase RNA provide an approach to the treatment of hepatocarcinoma.Key wordshepatoma telomerase;antisense oligodeoxynucleotide

7、s; apoptosis; gene transfection原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤之一，但對(duì)其具體發(fā)病機(jī)制人們依然不清楚，同時(shí)對(duì)原發(fā)性肝癌的治療也無(wú)非常有效的治療手段。近年的研究表明，端粒酶的活化是惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的重要分子基礎(chǔ)1-3。端粒酶是一種由RNA與蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白，其RNA中含有合成端粒DNA的模板序列。端粒酶以自身RNA為模板，在線性染色體末端合成端粒重復(fù)序列。端粒酶在大約90%的惡性腫瘤中表達(dá)，而在絕大多數(shù)正常細(xì)胞中卻檢測(cè)不到端粒酶活性。采用抑制端粒酶活性的手段達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的成為腫瘤治療的新策略。為探討抗端粒酶治療在原發(fā)性肝癌治療中的意義，

8、我們采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將潮霉素抗性的反義端粒酶RNA真核表達(dá)載體PBBS212/hTR轉(zhuǎn)入SMMC7721肝癌細(xì)胞中，采用TRAP-PCR-ELISA及FCM、電鏡觀察其對(duì)細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞凋亡的影響。以期為原發(fā)性肝癌基因治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法一、材料大腸桿菌JM109由本校生化教研室惠贈(zèng)，pBBS212-hTPR質(zhì)粒由美國(guó)Geron Corporation,Villeponteau博士惠贈(zèng)，該質(zhì)粒由一個(gè)200bp含端粒酶RNA模板序列的TRC3反義基因片段插入至PBBS212載體的EcoRI酶切位點(diǎn)而構(gòu)建,在mpsv啟動(dòng)子控制下表達(dá)反義hTR4，潮霉素(hygromycin)為

9、Sigma產(chǎn)品。TRAP-PCR-ELISA試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim公司。核酸內(nèi)切酶購(gòu)自Promega，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自GIBICO、SMMC7721細(xì)胞由本室保存培養(yǎng)。二、方法(一)pBBS212-hTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞：1.pBBS212-hTR質(zhì)粒的擴(kuò)增提取：按常規(guī)方法進(jìn)行，將pBBS212-hTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，經(jīng)核酸內(nèi)切酶EcoRI酶切后，電泳鑒定質(zhì)粒片段大小正確。2.pBBS212-hTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721細(xì)胞分為三組：對(duì)照組SMMC7721細(xì)胞、空載體組SMMC7721/

10、pBBS212細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組SMMC7721/pBBS212-hTR細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，培養(yǎng)48hrs后傳代加入含HyR 350ug/ml的培養(yǎng)液篩選抗性細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)兩周后，可見(jiàn)細(xì)胞克隆形成。(二)細(xì)胞周期分析收集不同處理的SMMC7721細(xì)胞，750mol/L酒精溶液固定，檢測(cè)前離心去酒精，加入250ugm/ml PI(碘化丙錠)0.2ml暗處放置30min上機(jī)檢測(cè)。測(cè)定細(xì)胞周期，觀察是否存在細(xì)胞凋亡。(三)透射電鏡觀察細(xì)胞經(jīng)0.01M pH7.4 PBS洗滌兩次，用3%戊二醛固定，鋨酸后固定，脫水，包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，電鏡下觀察不同處理

11、的細(xì)胞是否發(fā)生凋亡并照相紀(jì)錄。(四)TRAP-PCR-ELISA檢測(cè)端粒酶活性Telomerase-PCR-ELISA.AP試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim公司，細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)按照Telomerase-PCR-ELISA.AP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。并設(shè)立陽(yáng)性及陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在DYNATECH MR400儀器上檢測(cè)450nm/630nm處標(biāo)本的吸光度(A)值。結(jié)果一、細(xì)胞周期分析結(jié)果轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，貼壁性能差，易于消化，且早期有較多的細(xì)胞脫離瓶壁飄浮死亡，而在同樣培養(yǎng)條件下的對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好。收集轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA基因穩(wěn)定表達(dá)后的第4代細(xì)胞

12、作FCM檢測(cè)，結(jié)果顯示在G1期前有一亞二倍體的凋亡峰存在，凋亡細(xì)胞占全部細(xì)胞的13.8%(1)。對(duì)照組細(xì)胞則未見(jiàn)有凋亡峰出現(xiàn)，細(xì)胞周期結(jié)果分布列于附表。附表轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA SMMC7721細(xì)胞周期分布G1(%)G2(%)S(%)對(duì)照組48.716.334.9實(shí)驗(yàn)組64.14.231.7二、透射電鏡觀察結(jié)果轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞體積縮小，可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征：核膜完整，染色質(zhì)凝集并邊集于核膜，細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)破壞，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)有空泡形成，表現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)(見(jiàn)2)。對(duì)照組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本正常，未見(jiàn)有細(xì)胞凋亡發(fā)生。三、TRAP-PCR-EL

13、ISA結(jié)果TRAP-PCE-ELISA法的結(jié)果顯示SMMC7721細(xì)胞表達(dá)高水平的端粒酶活性，吸光度(A50A630)值為2.861，而轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)顯著下降，吸光度(A450A630)值為0.482。說(shuō)明轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA對(duì)SMMC7721細(xì)胞端粒酶活性有明顯的抑制作用。 討論端粒酶在大約90%的惡性腫瘤中表達(dá)，而在絕大多數(shù)正常細(xì)胞中卻檢測(cè)不到端粒酶活性，因此端粒酶的活性被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)1-3，故采用抑制端粒酶活性的手段達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的已成為腫瘤治療的新策略，反義技術(shù)作為“基因封條”能夠特異性封閉或譯制其靶基因的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道4-5

14、，利用與端粒DNA重復(fù)序列等同的6mer寡聚核苷酸可以抑制體外及動(dòng)物體內(nèi)Burkitls淋巴瘤細(xì)胞端粒酶活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，應(yīng)用反義端粒酶RNA封閉Hela細(xì)胞的端粒酶活性，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于反義RNA可以從復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯水平發(fā)揮作用，在轉(zhuǎn)染后可形成穩(wěn)定克隆細(xì)胞系，非常有利于特定基因的研究，因而它在基因調(diào)控及基因治療的研究中倍受重視。為此我們采用反義核酸來(lái)封閉SMMC721細(xì)胞端粒酶活性，以期探討抗端粒酶治療在原發(fā)性肝癌中的治療意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)顯著下降，吸光度(A450A630)值僅為0.482，SMMC7721表達(dá)高水平的

15、端粒酶活性，吸光度(A450A630)值為2.861；同時(shí)轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，貼壁性能差，易于消化，且早期有較多的細(xì)胞脫離瓶壁飄浮死亡，F(xiàn)CM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡(13.8%)，同期電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈顯著凋亡形態(tài)。我們的研究證明：反義端粒酶RNA能有效抑制肝癌細(xì)胞的端粒酶活性，同時(shí)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。我們還對(duì)轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA的SMMC7721細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞周期分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照組相比：G1期細(xì)胞數(shù)量增多，G2、S期細(xì)胞數(shù)量減少。有文獻(xiàn)報(bào)道6細(xì)胞端粒酶活性與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，抑制細(xì)胞端粒酶活性可引起細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子的表達(dá)

16、改變。細(xì)胞端粒酶活性主要表達(dá)在S期。這提示我們由于在S期細(xì)胞端粒酶活性受到抑制，致使細(xì)胞在G1/S期轉(zhuǎn)換受阻，影響細(xì)胞從G1期過(guò)渡到S期，并有可能延長(zhǎng)細(xì)胞周期。這也提示我們反義端粒酶在有效抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性同時(shí)，也有可能對(duì)細(xì)胞周期發(fā)生影響，使細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡發(fā)揮影響作用。總之，利用反義端粒酶抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性可以誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，并有可能影響細(xì)胞周期調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)研究在肝癌基因治療方面進(jìn)行了有益的探討。作者簡(jiǎn)介：張傳山(1966-)，男，天津市人，博士，講師。從事免疫病理與分子病理專(zhuān)業(yè)。張傳山（第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室陜西西安 710032）王文

17、亮（第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室陜西西安 710032）劉利（西京醫(yī)院血液科）胡沛臻（第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室陜西西安 710032）張衍?chē)?guó)（西京醫(yī)院血液科）馬福成（第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室陜西西安 710032）參考文獻(xiàn)1Haber DA.Telomerase,cancer and immortalityJ.New England J Med,1995;332(14):955-957.2Counter CM.Avillon AA,LeFeuvre CE,et al.Telomere shortening associated with chromosome instability is arreste

18、d in immortal cells which express telomerase activityJ.EMBO J 1992;11:1921-1929.3Shay JW,Werbin H,Wright WE.Telomere shortening may contribute to aging and cancerJ.Mol Cell Differ,1994;2:1-21.4Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomeraseJ.Science,1995;268:1236-1241.5Mata JE,Joshi SS,Palen B,et al.A hexameric phosphorothioate oligonucleotide telomerase inhibi