新型人轉(zhuǎn)錄因子hBKLF對(duì)K562細(xì)胞增殖、分化及血紅蛋白合成作用的研究

1、新型人轉(zhuǎn)錄因子hBKLF對(duì)K562細(xì)胞增殖、分化及血紅蛋白合成作用的研究                        作者：王茫桔 馬曉蕓 石永進(jìn) 武淑蘭 賀福初 【摘要】  孕22周的胎肝是胎兒的主要造血器官，其中含有大量與造血相關(guān)的調(diào)控因子。人堿性Krüppel樣因子(human basic Krüppel- like factor

2、,hBKLF)是本研究室從這一時(shí)期胎肝cDNA文庫中新克隆的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)其C端的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，它含有3個(gè)特征性C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，因此屬于KLF轉(zhuǎn)錄因子家族。前期的表達(dá)譜研究工作顯示，hBKLF在成人外周血白細(xì)胞、骨髓和胎肝中表達(dá)量高，在紅系中有表達(dá)，這提示它可能與造血相關(guān)。本研究以K562細(xì)胞為模型，研究hBKLF與造血細(xì)胞增殖、分化及血紅蛋白合成的關(guān)系。構(gòu)建hBKLF正義及反義真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，經(jīng)G418篩選4周，得到穩(wěn)定細(xì)胞株；用RT- PCR、Western blot方法測(cè)定轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞hBKLF表達(dá)水平的變化；以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的K562細(xì)胞為對(duì)照組，在顯微鏡下直接觀察轉(zhuǎn)

3、染正義質(zhì)粒和反義質(zhì)粒的兩組細(xì)胞形態(tài)的改變；用MTT法比較增殖速率的變化；用甲基纖維素半固體培養(yǎng)法比較集落形成率的差別；用苯息丁法觀察氯高鐵血紅素（hemin）誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化后血紅蛋白合成水平的差異。結(jié)果表明：正義質(zhì)粒和反義質(zhì)粒經(jīng)NcoI酶切鑒定構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)染正義質(zhì)粒的K562細(xì)胞（正義組）中hBKLF的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平增加，轉(zhuǎn)染反義質(zhì)粒的K562細(xì)胞（反義組）中hBKLF的mRNA水平降低。增殖活性在反義組、正義組、對(duì)照組分別為1.335±0.022、1.067±0.010、1.118±0.014，反義組K562細(xì)胞的增殖速率加快，正義組細(xì)胞增殖速率

4、減慢（P<0.001）。細(xì)胞形態(tài)在各組間無明顯區(qū)別。集落形成率在反義組、正義組、對(duì)照組分別為148±13、136±10、141±10，各組間無顯著差異（P>0.05）。3組細(xì)胞血紅蛋白合成水平在hemin誘導(dǎo)后均升高，誘導(dǎo)后血紅蛋白升高倍數(shù)在對(duì)照組、反義組、正義組分別為9.064±1.637、14.360±2.185、4.820±0.404，反義組K562細(xì)胞合成血紅蛋白能力增加，正義組合成血紅蛋白能力下降（P<0.05）。結(jié)論：hBKLF可以抑制K562細(xì)胞的增殖，對(duì)血紅蛋白合成有負(fù)調(diào)控作用，但未觀察到hBKLF對(duì)

5、細(xì)胞形態(tài)及克隆形成率的影響。 【關(guān)鍵詞】  hBKLF 血紅蛋白; K562; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞分化Effect of the New Human Transcription Factor hBKLF on the Prolifera-tion, Differentiation of K562 Cell Line and Hemoglobin SynthesisDepartment of Hematology, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China; 1Department of Genomics and Pr

6、oteomics,  Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Chinese National   Human Genome Center at Beijing,  Beijing 100850, China Abstract The human basic Krüppel-like factor （hBKLF）  is a newly cloned human transcription factor from the cDNA l

7、ibrary of fetal liver. It belongs to the Krüppel- like transcription factor family. Previous expression study showed that  it is a hematopoietic related factor. This study was aimed to investigate the effect of hBKLF  on cell proliferation, differentiation and hemoglobin synthesis by

8、using K562 cell line as model.  The sense and antisense expression plasmids of hBKLF were constructed, and transfected into K562 cells by lipofectamine. After G418 selection for  4 weeks, the cell line with stable expression of the gene was obtained. Then the hBKLF expression level, prolif

9、eration ability,  colony formation and hemoglobin production were detected by RT-PCR and Western blot, MTT method, methyl cellulose semisolid culture method and benzidine test respectively.  The morphologic change of cell was observed with inverted microscope.  The results  showe

10、d that  the sense plasmid could increase hBKLF level and antisense plasmid could decrease hBKLF expression. When hBKLF level was down-regulated,  K562 cells could proliferate more quickly and synthesize more hemoglobin. But there were no differences in colony formation ability and no appar

11、ent morphologic change.It is concluded  that hBKLF can inhibit hematopoietic cell proliferation and hemoglobin synthesis. It is suggested that hBKLF plays  an important role in the proliferation and differentiation of hematopoietic cells.Key wordshBKLF; hemoglobin; K562; cell prolifer

12、ation; cell differentiation人堿性Krüppel樣因子（human basic Krüppel- like factor， hBKLF)是我室近年從人胎肝cDNA文庫中克隆的新型轉(zhuǎn)錄因子1，其N端含3個(gè)連續(xù)的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，這是KLF轉(zhuǎn)錄因子家族的共同特征2，因此hBKLF是KLF家族的新成員。這一家族的成員還有EKLF3、GKLF4、LKLF5，IKLF6等。已知EKLF特異地調(diào)控珠蛋白的表達(dá)；GKLF、IKLF與細(xì)胞的增殖、分化有關(guān)；LKLF與T細(xì)胞的活化、記憶有關(guān),但hBKLF的功能尚不清楚。我室前期對(duì)hBKLF在人類胎兒組織、成人組織、造

13、血細(xì)胞中的表達(dá)譜研究提示，hBKLF可能與造血相關(guān)。本研究試圖以K562細(xì)胞為模型，研究hBKLF與造血細(xì)胞增殖、分化及血紅蛋白合成的關(guān)系。材料和方法細(xì)胞系、菌株、質(zhì)粒及試劑人胎肝cDNA文庫、K562細(xì)胞、COS-7細(xì)胞、JM109大腸桿菌、pcDNA3.1/myc-his C質(zhì)粒為我室保存。Wizard PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Wizard質(zhì)粒純化試劑盒、AMV高效逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Promega公司。小牛血清、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。RPMI 1640購(gòu)自Gibco公司。G418、MTT、Hemin購(gòu)自Sigma公司。Lipofectamine購(gòu)自Life technologies

14、公司。2.7%甲基纖維素由北大醫(yī)院血液科提供，1%苯息丁由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院九所提供。質(zhì)粒構(gòu)建 hBKLF正義引物P1：5-CAGAAGCTTACTAAA AGAATGCTCATGT-3 ，P2：5-ACTCTCGACTGA CTAGCATGTGGCG-3。反義引物：P3： 5-CAACT CGAGAACACCAGAGCACCCTAGAA-3，P4：5-ACGAAGCTTCCGATAAGGAGACCGTGAGA-3。 以人胎肝cDNA為模板，PCR擴(kuò)增hBKLF。PCR循環(huán)參數(shù)：94預(yù)變性5分鐘；94 1分鐘；58 1分鐘；72 1分30秒，共35個(gè)循環(huán)；72延伸7分鐘。產(chǎn)物經(jīng)1瓊脂糖凝

15、膠電泳分離，用Wizard PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，用HindIII/XhoI酶切后連入經(jīng)CIAP去磷酸化處理的pcDNA3.1/myc-his C質(zhì)粒Hind/Xho位點(diǎn)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，隨機(jī)挑取5-7個(gè)克隆，酶切鑒定。鑒定正確的克隆進(jìn)一步測(cè)序鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定株的篩選K562細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI  1640于37、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，將2×106/ml對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種0.8 ml；加入3-4 g質(zhì)粒與20 l lipofectamine的混合物，7-8小時(shí)后補(bǔ)充4 ml新鮮培養(yǎng)液，24-48小

16、時(shí)左右按15-10分瓶，72小時(shí)后加入G418（終濃度800 g/ml）篩選，每3天換液1次，篩選4周，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。用有限稀釋法將多克隆細(xì)胞以1個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板進(jìn)行單克隆化。COS- 7細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM（高糖）于37、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，將2×105/孔對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，至70%-80%融合，每孔加入2 g質(zhì)粒與10 l  Lipofectamine的混合物，繼續(xù)培養(yǎng)7-9小時(shí)后換液，轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)收獲細(xì)胞。蛋白表達(dá)的Western blot測(cè)定細(xì)胞用冰預(yù)冷的1×PBS洗2遍，按每孔500

17、60; l加入冰預(yù)冷的RIPA(1×PBS，0.1% SDS, 0.5%脫氧膽酸鈉，1% NP- 40)，冰上慢搖20分鐘后，將細(xì)胞刮下，4，12 000×g離心10分鐘，保留上清。蛋白樣品經(jīng)SDS- PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，電流按（2×cm2膜面積）mA，轉(zhuǎn)膜2-3小時(shí)，于TBSTM(5%脫脂奶，0.05%吐溫20)中4封閉過夜，用TBST(0.05%吐溫20)漂洗10分鐘，共3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)的抗myc抗體（12 000-15 000），室溫慢搖1小時(shí)，TBST漂洗3次后，TBS漂洗1次，ECL顯色5分鐘，壓片2分鐘。mRNA表達(dá)的RT- PCR檢測(cè)

18、常規(guī)方法提取細(xì)胞RNA，按AMV高效逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 g總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT- PCR比較hBKLF表達(dá)量的改變，循環(huán)參數(shù)同前。設(shè)GAPDH為參照，引物為P5：5-ACCACCATGGA    GAAGGCTGG-3，P6：5-CTCAGTGTAGCCCAGG ATGC- 3。MTT試驗(yàn)取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以3×104/ml重懸，按每孔200  l接種于96孔板中，培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入MTT（5 mg/ml）15 l，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后每孔加入100 l含0.01N  HCl的10 SDS，室溫振蕩溶解8小時(shí)，用酶標(biāo)儀

19、于570  nm處測(cè)定吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)5孔，求平均值作為各組的MTT值。集落形成率取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以1×104/ml重懸，按每孔100 l接種于6孔板中，同時(shí)加入1 ml RPMI 1640，1 ml胎牛血清，1 ml 2.7甲基纖維素。充分混合，培養(yǎng)7天后于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3孔。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取細(xì)胞直接于倒置相差顯微鏡下觀察。血紅蛋白測(cè)定細(xì)胞懸液用1×PBS洗2遍后用去離子水重懸，反復(fù)凍融3次，室溫15 000×g離心45分鐘，取100 l上清采用苯息丁法測(cè)定血紅蛋白含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3孔。苯息丁法測(cè)定游離血紅蛋白：設(shè)立空白

20、管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，按順序于小杯中加入1苯息丁0.5 ml、樣品0.1 ml、1 H2O2  0.5 ml，室溫下靜置20分鐘，然后加入10醋酸5 ml，靜置10分鐘后測(cè)定520 nm處吸光值。按公式計(jì)算樣品血紅蛋白含量。樣品中血紅蛋白濃度（測(cè)定管OD520 / 標(biāo)準(zhǔn)管OD520）×標(biāo)準(zhǔn)管血紅蛋白濃度×稀釋倍數(shù)。百事通 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理MTT值、克隆形成率、血紅蛋白升高倍數(shù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，各組細(xì)胞間的均值采用方差分析，均數(shù)間的多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。結(jié)果hBKLF正義及反義表達(dá)載體的構(gòu)建選擇pcDNA3.1/myc-hi

21、s C質(zhì)粒作為真核表達(dá)載體，使插入的基因以帶有myc-his標(biāo)簽的融合蛋白形式表達(dá)出來，便于用myc抗體檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。為了構(gòu)建正義質(zhì)粒，根據(jù)hBKLF cDNA序列設(shè)計(jì)正義引物，擴(kuò)增其完整ORF序列，正義引物使讀碼框與myc/his標(biāo)簽蛋白一致，正義下游引物不加終止密碼子，利用載體上終止密碼子，預(yù)期獲得1063 bp片段。反義引物擴(kuò)增跨越起始密碼子ATG的N端564 bp片段。引物的兩端帶有Hind/Xho酶切位點(diǎn)，但將其酶切位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)調(diào)，以便反向插入載體中。以上兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入pcDNA3.1/myc-his C載體的Hind/Xho多克隆位點(diǎn)，獲得的正義及反義重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)

22、序鑒定正確（圖1A，1B）。為了鑒定hBKLF正義質(zhì)粒是否能正確表達(dá)hBKLF/myc-his融合蛋白（41 kD），將其轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞，提取COS-7細(xì)胞在pcDNA3.1/ myc-his-hBKLF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后的總蛋白，采用Western blot方法用myc抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞中無hBKLF/myc-his融合蛋白，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中出現(xiàn)預(yù)期的41 kD條帶。這表明hBKLF的正義質(zhì)?？梢员磉_(dá)完整的hBKLF蛋白（圖2）。達(dá)hBKLF正義及反義基因的K562細(xì)胞株的建立為了觀察hBKLF對(duì)K562細(xì)胞增殖、分化、血紅蛋白合成的影響，分別用空質(zhì)粒、hBKLF正義質(zhì)粒、hBKLF反

23、義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，于800 g/ml G418中篩選4周，出現(xiàn)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞，單克隆化后分別提取各組細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)hBKLF表達(dá)水平。為了提高比較的靈敏度，分別在PCR的22、26、30個(gè)循環(huán)時(shí)取擴(kuò)增產(chǎn)物，比較各組在不同循環(huán)數(shù)時(shí)hBKLF的水平，結(jié)果如圖3。由圖3可以看到，正義細(xì)胞株中hBKLF表達(dá)量增加，反義細(xì)胞株中hBKLF表達(dá)量下降。這一結(jié)果表明正反義質(zhì)粒已經(jīng)穩(wěn)定整合入K562基因組中，且可以正常工作。hBKLF對(duì)K562細(xì)胞增殖速率、集落形成率及細(xì)胞形態(tài)的影響為了了解hBKLF對(duì)細(xì)胞增殖速率的影響，以同一密度將以上三組細(xì)胞株接種于96孔板中，采用

24、MTT方法觀察hBKLF對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果繪制成圖4。從圖4中可以看到，增殖活性在反義組、正義組、對(duì)照組分別為1.335±0.022，1.067±0.010，1.118±0.014。正義組增殖速率慢于對(duì)照組，而反義組增殖速率較對(duì)照組高（P<0.001），提示hBKLF可抑制造血細(xì)胞增殖。3組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上未觀察到明顯差異。反義組、正義組、對(duì)照組細(xì)胞的集落形成率分別為148±13，136±10，141±10，無顯著差異（P0.429）（圖5）。hBKLF對(duì)K562細(xì)胞血紅蛋白合成的影響K562細(xì)胞可以合成血紅蛋白，合成量在

25、hemin誘導(dǎo)下可增加。為了研究hBKLF表達(dá)水平對(duì)這一過程的影響，我們?cè)贖emin誘導(dǎo)前后采用苯息丁法測(cè)定各組細(xì)胞血紅蛋白的含量，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前各組細(xì)胞血紅蛋白表達(dá)水平均很低，且表達(dá)量相似，hemin誘導(dǎo)后各組細(xì)胞血紅蛋白表達(dá)量較誘導(dǎo)前均有增加，增加倍數(shù)在對(duì)照組、反義組、正義組分別為9.064±1.637，14.360±2.185，4.820±0.404(圖6)。這提示hemin誘導(dǎo)后各組細(xì)胞血紅蛋白合成能力不同，反義組細(xì)胞合成血紅蛋白量較對(duì)照組增加，正義組較對(duì)照組下降（P<0.05）。因此，hBKLF對(duì)K562的基礎(chǔ)血紅蛋白表達(dá)量影響不大，但可能抑制h

26、emin誘導(dǎo)的血紅蛋白的表達(dá)。討論Krüppel轉(zhuǎn)錄因子家族是鋅指蛋白超家族的一個(gè)亞家族，它們的共同特征是在蛋白的C端含3個(gè)連續(xù)的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，由于這種鋅指結(jié)構(gòu)與果蠅分節(jié)蛋白Krüppel類似，因而得名Krüppel- like factor2。這一家族中首先被發(fā)現(xiàn)的是EKLF3，EKLF 敲除小鼠在胎肝定向造血開始建立時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重貧血，胎肝蒼白，最終死于宮內(nèi)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，貧血是由于珠蛋白合成減少導(dǎo)致的，說明EKLF對(duì)于珠蛋白合成至關(guān)重要。其他能夠調(diào)控珠蛋白合成的KLF分子還有FKLF11、FKLF212。我室從人胎肝cDNA文庫中克隆的hBKLF,其C端

27、含有典型的類Krüppel鋅指結(jié)構(gòu)，因此它是KLF家族的新成員。hBKLF是否同樣參與珠蛋白轉(zhuǎn)錄的調(diào)控呢？從我室前期對(duì)hBKLF表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)1，它確實(shí)在紅細(xì)胞中有表達(dá)，并且表達(dá)量隨著紅細(xì)胞的成熟而增加。這進(jìn)一步提示hBKLF可能與珠蛋白表達(dá)有關(guān)。由于K562細(xì)胞表達(dá)hBKLF1,同時(shí)可以表達(dá)、珠蛋白，具有向紅系分化的特征，因此K562細(xì)胞是研究hBKLF功能的理想模型7-10。本研究試圖通過正義質(zhì)粒及反義質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞來提高或降低K562細(xì)胞內(nèi)hBKLF水平，比較它們對(duì)K562細(xì)胞血紅蛋白合成的影響，同時(shí)觀察hBKLF對(duì)細(xì)胞形態(tài)、增殖速率、克隆形成率的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義

28、質(zhì)?？梢燥@著提高h(yuǎn)emin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞血紅蛋白的表達(dá)量，提示hBKLF在體內(nèi)可能抑制血紅蛋白的表達(dá)，是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，而以往發(fā)現(xiàn)的EKLF、FKLF11、FKLF212等都是激活血紅蛋白表達(dá)的，這一結(jié)果為血紅蛋白復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理增加了新的解釋，對(duì)于hBKLF在眾多調(diào)控血紅蛋白的分子中的角色提出了新的問題。對(duì)于以上結(jié)果另外可能的解釋是，血紅蛋白不是hBKLF的靶基因，其表達(dá)量的改變不是hBKLF的直接作用，而是由于其信號(hào)調(diào)控通路中的其他分子受到了hBKLF的影響，這些分子才是hBKLF真正的靶基因。結(jié)果還表明，反義質(zhì)?？梢悦黠@提高K562的增殖速率，提示hBKLF能夠抑制細(xì)胞增殖。這可能是

29、通過抑制細(xì)胞分裂或促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，因此，hBKLF的靶基因中可能存在抑制細(xì)胞增殖或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子。因此，尋找hBKLF的靶基因?qū)τ陉U明它的功能是十分重要的，目前對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子的特異性不僅取決于DNA結(jié)合區(qū)的結(jié)合特性，還取決于轉(zhuǎn)錄功能區(qū)介導(dǎo)的不同的蛋白質(zhì)間的相互作用。hBKLF的DNA結(jié)合區(qū)高度保守的結(jié)合特征使凡是具有CACCC盒的基因都有可能成為它的靶基因，那么其N端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)就是至關(guān)重要的。搞清與hBKLF N端相互作用的蛋白質(zhì)成分，將有助于解釋它的功能?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 王茫桔,瞿祥虎,王立升等. 人類新型Krüppel類轉(zhuǎn)錄因子hBKLF的

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