當(dāng)歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后CDK2蛋白的表達(dá)

1、當(dāng)歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后CDK2蛋白的表達(dá)                         作者：馮金彩 喻小紅 李培安【摘要】  目的：觀察當(dāng)歸對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白表達(dá)的影響，探討當(dāng)歸抗心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)理。方法:將35只SD大鼠隨機(jī)分成4組：正常對照組(n=5)、假手術(shù)組(n=10)、缺血再灌注組(n=10)、當(dāng)

2、歸治療組(n=10) ,建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實(shí)驗(yàn)完畢后，將各組動物心肌組織做免疫組織化學(xué)染色，觀察各組動物心肌細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白表達(dá)的變化。利用HPIAS-2000圖像分析系統(tǒng)測定CDK2蛋白在以上各組中表達(dá)的平均光密度和平均陽性面積率。結(jié)果：正常對照組心肌細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白表達(dá)弱；當(dāng)歸治療組心肌細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白表達(dá)弱。假手術(shù)組心肌細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白表達(dá)強(qiáng)，缺血再灌注損傷組CDK2蛋白表達(dá)強(qiáng)。圖像分析結(jié)果顯示，正常對照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間CDK2蛋白的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與

3、假手術(shù)組之間平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液對大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的增殖起著重要的作用。 【關(guān)鍵詞】  當(dāng)歸注射液 缺血再灌注 心肌 CDK2蛋白心肌缺血再灌注損傷( ischemia reperfusion injury, IRI )在急性心肌梗死再灌注治療的病理生理過程中起著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。趙明中等1研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注可減少心肌缺血細(xì)胞凋亡,同時(shí)也能加速受損心肌細(xì)胞的凋亡過程，且凋亡細(xì)胞主要位于心肌纖維收縮帶區(qū)域內(nèi)和心肌梗死區(qū)周圍。心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡隨再灌注時(shí)

4、間的延長而顯著增多。近年來凋亡機(jī)制參與心肌缺血再灌注損傷成為臨床研究的熱點(diǎn)。    目前在研究藥物治療心肌缺血方面還沒有任何一種能絕對減少心肌梗死,對抗心肌缺血。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性溫，能補(bǔ)血和血,調(diào)經(jīng)止痛,潤燥滑腸。有文獻(xiàn)報(bào)道2, 當(dāng)歸對冠心病患者應(yīng)用當(dāng)歸注射液治療能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性ST-T 的變化, 是治療冠心病的有效藥物3。    CDK2是酪氨酸蛋白激酶家族的成員之一，其基因定位于染色體1

5、2q13，編碼33ku的蛋白質(zhì)，為蘇氨酸激酶，是細(xì)胞周期素依賴性激酶復(fù)合體的一個(gè)亞基，在G1/S期的轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用。而G1/ S 的調(diào)控點(diǎn)又是細(xì)胞內(nèi)外信號經(jīng)過傳遞、整合匯集到細(xì)胞核,對細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)4。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察當(dāng)歸注射液對缺血/ 再灌注過程心肌的保護(hù)作用,研究當(dāng)歸注射液抗心肌缺血/ 再灌注損傷的作用機(jī)理，旨在指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用當(dāng)歸治療心血管疾病,開辟當(dāng)歸在體外循環(huán)手術(shù)前和術(shù)中應(yīng)用的新途徑。 1  材料與方法1.1  動物模型制備及分組    選用健康雄性Wistar大鼠（SPF級）35只,體重2503

6、00g左右。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg?(100 g)-1 ,麻醉動物后行氣管切開接微型呼吸機(jī)人工呼吸呼吸頻率60 次?min-1 ,潮氣量2ml?(100g)-1,沿胸骨左緣第4肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎/ 開放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動物隨機(jī)分成4組: 正常對照組（不做任何處理）；假手術(shù)組（絲線穿過冠狀動脈前降支但不結(jié)扎）；缺血再灌注損傷組(IR)（ 缺血/ 再灌注前靜脈注射生理鹽水0.8ml / kg，結(jié)扎左冠狀動脈前降支45min ,再灌注120 min ）；當(dāng)歸注射液預(yù)處理組（在結(jié)扎前20min靜脈注射當(dāng)歸注射液0.8ml/ kg , 其它處理同

7、缺血/ 再灌注組）。1.2  主要試劑    25%當(dāng)歸注射液(武漢大學(xué)中南醫(yī)院制藥廠)；即用型兔抗鼠CDK2單克隆抗體；即用型S-P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。以上試劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3  方法1.3.1  常規(guī)HE染色。1.3.2  免疫組織化學(xué)S-P法檢測CDK2相關(guān)抗原  主要步驟：5m組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，CDK2采用高壓抗原修復(fù)，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4 孵育過夜，生物素標(biāo)

8、記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組，人乳腺癌作為CDK2的陽性對照組。1.4  免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷    CDK2以細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對CDK2抗原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算

9、陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。2  結(jié)果    CDK2蛋白的表達(dá)：正常對照組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，CDK2蛋白表達(dá)弱；假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)也可見少量的棕黃色顆粒，CDK2蛋白表達(dá)弱；缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，CDK2蛋白表達(dá)強(qiáng)；當(dāng)歸治療組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，CDK2蛋白表達(dá)弱。圖像分析結(jié)

10、果顯示：正常對照組的平均光密度為0.1561±0.0072; 假手術(shù)組的平均光密度為0.1538±0.0064; 缺血再灌注損傷組的平均光密度為2.4213±0.1837; 當(dāng)歸治療組的平均光密度為0.1486±0.0368。正常對照組的陽性面積率為0.0836±0.0458; 假手術(shù)組的陽性面積率為0.0756±0.0193; 缺血再灌注損傷組的陽性面積率為2.2475±0.0095;當(dāng)歸治療組的陽性面積率為0.0764±0.0327。經(jīng)單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P0.05)。經(jīng)q 檢驗(yàn)，正常對照

11、組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間CDK2蛋白的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間CDK2蛋白的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。表1  當(dāng)歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后各組CDK2蛋白表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（略）注：*   正常對照組、假手術(shù)組、當(dāng)歸治療組與缺血再灌注損傷組比較， P0.01；# 當(dāng)歸治療組、假手術(shù)組與正常對照組比較， P0.05。3  討論    細(xì)胞凋亡(apop

12、 tosis)是細(xì)胞死亡形式之一,是有核細(xì)胞在一定條件下啟動其自身內(nèi)部機(jī)制,通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生自然死亡的過程。越來越多研究表明,心肌缺血/再灌注( I/R)損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。當(dāng)歸含有阿魏酸、多種磷脂、人體必需氨基酸和微量元素等。目前已證明,當(dāng)歸對心血管系統(tǒng)、血液造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的藥理作用。在心血管疾病中,經(jīng)常發(fā)生缺血再灌注損傷,其機(jī)制可能是多因素的,但主要有三個(gè)環(huán)節(jié):即能量代謝失常、鈣超載和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注損傷的直接原因6。缺血再灌注過程中,機(jī)體可通過多種途經(jīng)產(chǎn)生氧自由基,氧自由基與生物膜發(fā)生一系列反應(yīng),可破

13、壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、損傷心肌細(xì)胞膜, 產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷慨念以來，已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。大量動物實(shí)驗(yàn)顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過程。目前雖然對缺血或缺血再灌注損傷的確切機(jī)制還不十分清楚,但巳經(jīng)知道損傷的臨床結(jié)局主要就是細(xì)胞死亡。已經(jīng)證實(shí),人類心肌梗死除細(xì)胞壞死外,細(xì)胞凋亡也參與了梗死的病理過程,細(xì)胞凋亡不僅影響梗死面積,而且促成心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu),心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡現(xiàn)象79。缺血再灌注損傷對心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能的影響一直是研究的

14、重點(diǎn)之一。百事通    細(xì)胞周期的精密調(diào)控是細(xì)胞正常生長的關(guān)鍵性因素，而一系列的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是細(xì)胞周期調(diào)控的核心裝置10。CDKs的活性受到多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，包括與調(diào)節(jié)亞單位cyclins結(jié)合，磷酸化與去磷酸化以及與CDK抑制因子CKIs結(jié)合。CDK2是酪氨酸蛋白激酶家族的成員之一，其基因定位于染色體12q13，編碼33ku的蛋白質(zhì)，為蘇氨酸激酶，是細(xì)胞周期素依賴性激酶復(fù)合體的一個(gè)亞基，在G1/S期的轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，而G1/ S 的調(diào)控點(diǎn)又是細(xì)胞內(nèi)外信號經(jīng)過傳遞、整合匯集到細(xì)胞核,對細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)11。該點(diǎn)調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)

15、展關(guān)系密切。在G1 期中, cyclinE 和CDK2 結(jié)合形成cyclinE-CDK2復(fù)合物，它不僅作用于G1/ S 期,還對于DNA 復(fù)制的啟動非常重要。在G1 期中，cyclin 和CDK結(jié)合，導(dǎo)致CDK活化使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因( retinobla-stoma, Rb) 的蛋白產(chǎn)物磷酸化,失去對轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 的抑制, E2F-1 作用于二氫葉酸還原酶靶基因,加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期12。因此CDK2活性增高，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子。Aikawa T等在非腎系細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增生時(shí)CDK2的表達(dá)明顯增高，而細(xì)胞處于靜止時(shí)CDK2水平則較低13。

16、HuyHaodao等人在研究不同劑量內(nèi)皮素對體內(nèi)小血管的作用的過程中也發(fā)現(xiàn)，低劑量的內(nèi)皮素只能使內(nèi)皮細(xì)胞肥大，CDK2的水平處于一般狀態(tài)，而高劑量的內(nèi)皮素能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，同時(shí)可以檢測到CDK2激酶活性增強(qiáng)，CDK2表達(dá)水平也相應(yīng)升高14。另有學(xué)者在對結(jié)腸癌，食管鱗狀細(xì)胞癌及非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)都有CDK2表達(dá)及其活性的增高，其異常激活參與腫瘤的惡性進(jìn)展。Volm等用免疫組化的方法研究顯示在40例兒童組急性白血病患者中CDK2表達(dá)增高。這些研究均提示CDK2與細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，其異常表達(dá)能促使細(xì)胞增殖加速。    本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察當(dāng)歸注射液

17、對缺血/ 再灌注過程心肌組織中CDK2蛋白的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間CDK2蛋白的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。因此我們推測CDK2在當(dāng)歸注射液對缺血/ 再灌注過程心肌組織中發(fā)揮了細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)因子的作用。     缺血再灌注損傷本身是個(gè)多因素協(xié)同的過程,缺血再灌注組織發(fā)生細(xì)胞凋亡的機(jī)制也是一個(gè)多因素的過程,心肌細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡有著一些共同的始動因素,如氧自由基、

18、鈣離子超載、細(xì)胞因子的釋放、中性粒細(xì)胞侵潤等既可以引起細(xì)胞凋亡,也可以引起細(xì)胞壞死。無疑通過各個(gè)環(huán)節(jié)對抗細(xì)胞凋亡必然也會對抗細(xì)胞的壞死起一定的作用?，F(xiàn)在對心肌缺血再灌注引起細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚未闡明,對抗心肌細(xì)胞凋亡的治療也大多處于動物試驗(yàn)階段。特別是基因治療離臨床應(yīng)用還有一段距離。    從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論來分析當(dāng)歸注射液為防治缺血再灌注損傷的應(yīng)用具有重要的研究意義，并且為加強(qiáng)心肌保護(hù)作用提供重要的理論依據(jù)。并進(jìn)一步證實(shí)缺血后處理對再灌注心肌細(xì)胞具有抗凋亡作用, 提示缺血后處理的心肌保護(hù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 趙明中,陳運(yùn)貞. 大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌

19、注時(shí)細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化及意義. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2000,20(1):5255.2 魏蕾,歐陽靜萍,王雄,等. 當(dāng)歸對高分子右旋糖酐誘導(dǎo)人紅細(xì)胞聚集性增強(qiáng)的影響. 微循環(huán)學(xué)雜志,2001 ,11 (1) :3031.3 袁新初,張端蓮. 當(dāng)歸注射液對更年期大鼠超氧化物歧化酶和脂質(zhì)過氧化物的影響.中草藥,2001 ,32 (9) :822823.4 Ito Y, Takeda T, Sasald Y, et a l. Expression of p57KIP2 protein in extrahepatic bile duct carcinoma and intrehepatic cholang

20、iocellular carcinoma . Liver,2002, 22(2):145149 .5 Ito Y, Yoshida H, Nakano k, et al . Expression of p57KIP2 protein in normal and neoplastic thyroid tissues. Int J Mol Med, 2002, 9(4):373376.6 Ito Y, Takeda T, Sasald Y, et al. Expression of p57KIP2 protein in extrahepatic bile duct carcinoma and in

21、trehepatic cholangiocellular carcinoma. Liver,2002, 22(2):145149 .7 齊麗彤,張鈞華,李大元,等.血管緊張素-型受體阻斷劑抑制大鼠缺血-再灌注模型心肌細(xì)胞凋亡. 中華心血管病雜志,2001, 29 (2) : 118121.8 徐新春.鈣超載與心肌缺血再灌注損傷. 心血管病學(xué)進(jìn)展,2000 ,21 (4) : 227.9 Parlakpinar H, Sahna E. Protective effect of caffeic acid phenethylester (CAPE) on myocardial ischemia-reperfusion induced apoptotic cell death. Toxicology, 2005,209(1):114.10 Ito Y, Yoshida H, Nakano k, et al . Express