深黃被孢霉Δ6脂肪酸脫氫酶基因的原核表達(dá)和轉(zhuǎn)基因植株再生研究

1、深黃被孢霉6脂肪酸脫氫酶基因的原核表達(dá)和轉(zhuǎn)基因植株再生研究         09-09-25 11:23:00     編輯：studa20                   作者：王廣科, 李明春, 李晉川, 刑來君【摘要】  目的 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于深黃被孢霉的6脂肪酸脫氫酶(D6D)基

2、因?qū)氲綎|北大豆綏農(nóng)10和吉林47中，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株。方法 利用子葉節(jié)外植體誘導(dǎo)出叢生芽和再生植株，利用卡那霉素的抗性篩選培養(yǎng)基連續(xù)篩選以及PCR方法、DNA分子雜交分析和GC分析檢測轉(zhuǎn)基因植株中的6脂肪酸脫氫酶基因表達(dá)狀況。結(jié)果 經(jīng)過含50 mg/L卡那霉素的抗性篩選培養(yǎng)基連續(xù)篩選，獲得了一批轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR檢測和DNA分子雜交分析，初步證明6脂肪酸脫氫酶基因已導(dǎo)入并整合到大豆基因組中。將轉(zhuǎn)基因大豆T1代和T2代種子進(jìn)行脂肪酸GC分析，結(jié)果在大豆種子中檢測到6脂肪酸脫氫酶基因的產(chǎn)物GLA，證明該基因在大豆中得到了表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  6脂肪酸脫氫酶基因； 大豆； 農(nóng)桿菌介導(dǎo)

3、轉(zhuǎn)化； 脂肪酸GC分析； 轉(zhuǎn)基因植株    【Abstract】  Objective The 6fatty acid desaturase genes from Mortitieralla isabellina were introduced into suinong10 and  jilin47 via Agrobacterium infection method, some transgenic soybean were obtained. Methods Adentitious buds and regenerated plants w

4、ere inducted from cotylendon nodes, Kanamycin resistant culture medium, PCR Southern blot and GC analysis detected condition of the 6fatty acid desaturase genes of transgenic plants. Result Kanamycin resistant(Kmr) transgenic plants were obtained by screening in selective condition. PCR and Southern

5、 blot analysis from transgenic plants proved that the 6fatty acid desaturase genes were transferred and integrated into soybean genomes. Total fatty acids extracted from the positive transgenic soybean were analyzed by gas chromatography (GC) of methyl esters to confirm the transgenic soybean contai

6、ning a functional 6fatty acid desaturase gene. The presence of GLA indicated that the 6fatty acid desaturase genes from Mortitieralla isabellina were expressed in transgenic soybeans.    【Key words】  6fatty acid desaturase gene;Soybean(Glycin max L.);Agrobacteriummediated transfo

7、rmation;GC analysis of fatty acid;transgenic plant     GLA是多烯不飽和脂肪酸1（Polyunsaturated Fatty Acid，PuFA）n6代謝路線中的一種重要的脂肪酸1，它作為人體必需脂肪酸（Essential fatty acid，EFAs），對人體具有雙重功能，既是人體的必需營養(yǎng)元素，又是治療疾病的重要藥物。它在人體中可以轉(zhuǎn)化為二高亞麻酸（DGLA）和花生四烯酸（AA），二者是合成前列腺素類物質(zhì)的前體,對人體的激素調(diào)節(jié)及脂肪酸代謝發(fā)揮著重要的生理作用2。所以由GLA開始的一系列相關(guān)不

8、飽和脂肪酸的研究將會(huì)在醫(yī)藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、生物學(xué)等方面展開一個(gè)新的、更廣闊的研究領(lǐng)域3。從亞油酸到亞麻酸是由6脫氫酶催化的，6脫氫酶是以亞油酸為底物，在C6位上脫氫形成GLA.然后，通過碳鏈延長和脫氫作用，進(jìn)一步形成花生四烯酸、前列腺素和白三烯類等生理活性物質(zhì)。由于6脫氫這一步是 GLA形成的限速步驟，而且是由D6D催化的，因而D6D是GLA合成的關(guān)鍵因素4,5。近年來，先后報(bào)道了從高山被孢霉中分離出6脂肪酸脫氫酶，并分別在酵母、米曲霉和煙草中獲得功能性表達(dá)。    大豆是主要的油料作物之一，富含亞油酸，而不含亞麻酸或含量極低。本實(shí)驗(yàn)室從1989年開始研究微生物發(fā)酵生

9、產(chǎn)亞麻酸。近年來，對產(chǎn)亞麻酸的關(guān)鍵酶6 脂肪酸脫氫酶進(jìn)行了克隆和序列分析，從高產(chǎn)亞麻酸的深黃被孢霉菌株中克隆出6脂肪酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)基因，是世界上第十個(gè)克隆出該基因的實(shí)驗(yàn)室，在GenBank中的序列接收號為AF307934，并在酵母和煙草中得到表達(dá)69，這為將該基因轉(zhuǎn)化到大豆中提供了前提和基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將該基因轉(zhuǎn)化到東北大豆品種綏農(nóng)10和吉林47兩個(gè)品種中，得到了一批轉(zhuǎn)基因植株。    1  材料與方法    11  植物材料    綏農(nóng)10和吉林47等兩個(gè)優(yōu)良品

10、種，由吉林省農(nóng)科院大豆研究所提供。    12  菌株與質(zhì)粒    Agrobacterium tumefaciens LBA4404，由中科院微生物所方榮祥先生饋贈(zèng)。pGA643（Kanr），由內(nèi)蒙古大學(xué)哈斯阿古拉教授惠贈(zèng)。pTMICL6（Ampr）（全長MI D6D cDNA），南開大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室保存。    13  主要試劑    UNIQ10柱式多用途DNA純化試劑盒、dNTP Mix、上游引物9651、下游引物w21500均購自上海Sangon公

11、司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、卡那霉素、利福平和鏈霉素等主要購自華美生物工程公司、寶生物公司；地高辛標(biāo)記和檢測試劑盒購自德國Roche公司；Taq DNA聚合酶、Taq DNA plus 購自鼎國生物技術(shù)有限公司；亞麻酸（GLA）標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。    14  培養(yǎng)基的配制    LB、YEB、MS及MSB培養(yǎng)基配方參見文獻(xiàn)10。    15  抗生素與激素的配制    配制方法參見文獻(xiàn)10。  

12、  16  植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化    參照文獻(xiàn)10的分子克隆方法構(gòu)建出含有6脂肪酸脫氫酶基因的pGMICL6表達(dá)載體，將該表達(dá)載體經(jīng)電轉(zhuǎn)化到LBA4404根癌農(nóng)桿菌中。    17  農(nóng)桿菌的培養(yǎng)    從保存的農(nóng)桿菌平板上挑取含有表達(dá)載體的單菌落，接入含有50 mg/L Kan、25 mg/L Rif、25 mg/L Str的YEB培養(yǎng)基中，28，145 r/min振蕩培養(yǎng)。    18  農(nóng)桿菌介導(dǎo)6脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)

13、化大豆    挑取無病斑且種皮完好的大豆種子，清水浸泡過夜后去種皮，置于1/2 MSB 或MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，幾天后獲得無菌苗。切取子葉節(jié)外植體并制造傷口并農(nóng)桿菌菌液感染，感染后置于幼芽固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化出芽。待抗性芽在伸長培養(yǎng)基中長到34 cm后轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中，1520 d后可得到大豆轉(zhuǎn)基因抗性小植株，當(dāng)根充分發(fā)育后，將幼苗移栽到花盆?？剐栽偕缭诨ㄅ枥飪蓚€(gè)月開始結(jié)籽，收獲后，對部分子1代的種子進(jìn)行脂肪酸組成和含量的測定，其余種子種于溫室中，即為T1代轉(zhuǎn)基因植株。    19  轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 

14、60;  取卡那霉素篩選過的轉(zhuǎn)基因植株，用CTAB法提取總DNA，用于PCR擴(kuò)增6脂肪酸脫氫酶基因。上游引物序列P1(9651)：5GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT3（Xba）;下游引物序列P2(W21500)：5CTGCAGATCTTTACTGCGCCTTACC3(Bgl)。反應(yīng)條件：94 5 min94 1 min53 1 min72 2 min35cycles72 10 min.    110  轉(zhuǎn)基因植株的Southern檢測    大量提取PCR反應(yīng)陽性大豆轉(zhuǎn)基因植株的總DNA，Hind單酶切后經(jīng)過電泳及轉(zhuǎn)膜步驟與地高辛標(biāo)記的6脂肪酸脫氫酶基因的探針雜交，具體步驟見雜交試劑盒說明書。    111  轉(zhuǎn)基因大豆脂肪酸的氣相色譜（GC）分析    取一粒轉(zhuǎn)基因陽性大豆種子，提取脂肪酸后進(jìn)行氣相色譜（GC）分析，氣相色譜測定由南開大學(xué)中心