熒光原位雜交法檢測先天性心臟錐干畸形患者22號染色體長臂微缺失

1、    熒光原位雜交法檢測先天性心臟錐干畸形患者 22號染色體長臂微缺失        先天性心臟錐干畸形(conotruncal defects, CTD)是胚胎期心臟圓錐動脈干發(fā)育缺陷所致的一類先天性心臟病，約占先天性心臟病的30%，主要包括主動脈弓離斷(IAA)、主動脈右置(DA)、永存動脈干(TA)、法洛四聯(lián)癥(TOF)、大血管轉(zhuǎn)位(TGA)等。CTD多單獨發(fā)生，但在先天性胸腺發(fā)育不全(DiGeorge syndrome, DGS)和腭-心-面綜合征(vel

2、o-cardio-facial syndrome, VCFS)中CTD的發(fā)生率遠遠高于其在總?cè)巳褐械陌l(fā)病率1-3。已經(jīng)證明，DGS和VCFS是由22號染色體長臂近端(22q11)的微缺失所致的遺傳綜合征1-4。由此推測在22q11內(nèi)可能存在一個或一組控制心臟圓錐動脈干分化發(fā)育的基因，該基因的缺失或異?？蓪е翪TD的發(fā)生。為了探索22q11微缺失與CTD的關(guān)系，我們采用22q11內(nèi)的特異性N25探針和異硫氰酸熒光素(FITC)檢測系統(tǒng)，用染色體熒光原位雜交法(FISH)和染色體核型分析法對19例CTD患者進行了22q11微缺失的檢測，結(jié)果報告如下。 1材料和方法1.1研究對象臨床確診的CTD患者

3、19例(男17例，女2例)；年齡1天17歲。其中TOF7例、TA2例、IAA2例、TGA8例。上述病例分別取自我院兒科、心外科、心導管室和心臟彩色多譜勒檢查室。其心臟畸形均經(jīng)彩色多譜勒確診，部分病例經(jīng)心導管檢查和或經(jīng)心外科手術(shù)證實。19例患者中2例合并非心臟畸形：病例12懸雍垂缺如、腭裂，病例17有右上瞼下垂、眼裂寬、體格發(fā)育落后。19例均無智力障礙和先天性心臟病家族史，均未被診斷為DGS或VCFS。1.2檢測試劑地高辛標記的22q11內(nèi)的N25DNA探針、FITC標記的羊抗地高辛抗體、兔抗羊抗體及FITC標記的抗兔抗體均由美國費城兒童醫(yī)院細胞遺傳室李孟榮博士惠贈，有絲分裂刺激劑PHA-M購自

4、美國SIGMA公司；其它試劑均為國產(chǎn)。1.3檢測方法1.3.1染色體核型分析按微量外周血淋巴細胞培養(yǎng)法制備中期染色體標本，采用染色體G顯帶(320550條帶)技術(shù)進行核型分析，每例患者分析30個中期分裂相。1.3.2FISH檢測玻片經(jīng)變性后，與地高辛標記的N25探針雜交過夜；漂洗后，用間接免疫熒光技術(shù)，依次加FITC標記的抗地高辛、兔抗羊抗體、FITC標記的抗兔抗體行信號擴增；碘丙錠(PI)復(fù)染；在Nikon FX-35DX熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長430nm，阻滯波長510nm，每份標本分析20個分裂相；用Kodak400負片拍照。2結(jié)果2.1常規(guī)染色體分析19例均做常規(guī)G顯帶，按國際命名體

5、制進行核型分析，每例患者分析30個中期分裂相，均未發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目的異常。2.2FISH檢測19例中有17例可見正常雜交信號，即每個分裂相中均可在2條小染色體(22號)的長臂上見到黃綠色雜交信號，提示無22q11缺失。另2例的每個分裂相中僅可見一條小染色體上有雜交信號，提示另一條22號染色體上存在22q11的微缺失。存在22q11缺失的2例患者中，病例7無明顯心臟外的畸形，病例12伴有腭裂和懸雍垂缺如。3討論先天性心臟病是胎兒時期心臟、血管發(fā)育異常而致先天性缺陷，活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率為78，其病因尚不完全明確。一般認為先天性心臟病(CHD)是一類多基因病，其發(fā)生受遺傳因素和環(huán)境因素(宮內(nèi)環(huán)境

6、)的雙重影響。CTD是心臟圓錐動脈干發(fā)育異常，約占CHD的13，其在總?cè)巳褐械陌l(fā)生率約為2.5(78×13)，而在DGS和VDFS中發(fā)生率卻高達80%以上。CATCH22綜合征是由22q11微缺失所致的，以心臟畸形、面容異常、胸腺發(fā)育不全、腭裂和低鈣血癥為臨床特征的一種遺傳綜合征，它包括DGS、VCFS和一部分單純CTD等。CATCH22綜合征的臨床表型變異范圍十分廣泛，DGS為其中最為嚴重的一種，可因各種嚴重的缺陷或嚴重的感染而早期夭亡；有些病例則十分輕微，以致于不被發(fā)現(xiàn)，待其子女發(fā)生典型的DGS或VCFS而進行家系調(diào)查時始被發(fā)現(xiàn)。我們研究結(jié)果顯示19例CTD患者中有2例(219)

7、存在22q11微缺失，其中一例有顱面畸形，另一例未發(fā)現(xiàn)心臟以外的畸形，均未被診斷為DGS或VCFS，說明有一部分非綜合征性CTD實際上是CATCH22綜合征的一部分。病例12可能就是不典型的VCFS病例，進一步追蹤觀察可能會發(fā)現(xiàn)典型的VCFS的特征。我們認為凡是CTD患者，無論其是否合并有其它的畸形或異常，均應(yīng)進行22q11微缺失的檢測。在CTD中檢測22q11微缺失的意義在于它可作為不典型CATCH22綜合征的診斷依據(jù)，一方面有助于及時發(fā)現(xiàn)和矯治一些出生后才表現(xiàn)出來的先天性缺陷，如語言發(fā)育障礙、學習能力低下、精神異常、免疫力低下等。另一方面有助于提高遺傳咨詢的準確性。CTD在總?cè)巳褐械陌l(fā)病率

8、約為2.5，但對于一個存在22q11微缺失或22q11平衡易位的人來說，無論其臨床表現(xiàn)輕重如何，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，其后代獲得這一染色體異常的機率是50%，后者有可能是嚴重的CATCH22綜合征患者。當發(fā)現(xiàn)患兒有22q11微缺失時，應(yīng)對其父母進行同樣的檢測，以便為他們生育第2胎提供準確的遺傳咨詢。對于有高再發(fā)風險者(父母一方或雙方存在22q11微缺失或平衡易位)，再孕時還應(yīng)采用FISH技術(shù)為其胎兒進行早期產(chǎn)前診斷4,5，如發(fā)現(xiàn)胎兒存在22q11微缺失，應(yīng)建議孕婦及早終止妊娠。Van Hemel等5首先將這一檢測用于產(chǎn)前診斷，結(jié)果證實了其臨床實用價值，他們檢出1名存在22q11微缺失的胎兒，出生

9、后成為典型的DGS患者。我們研究中，用FISH方法發(fā)現(xiàn)2例存在22q11微缺失，而染色體核型分析均為正常，說明用FISH方法檢測22q11微缺失更靈敏、準確、特異。但由于DNA探針的高度特異性，一種探針只能檢測某一個位點，而不能同時觀察其它染色體或位點的異常，因此，F(xiàn)ISH方法應(yīng)與常規(guī)染色體核型分析結(jié)合應(yīng)用，從而獲得更多的細胞和分子遺傳學信息。作者單位：楊菊先金潤銘何美娟孟浦肖燕付平林雯劉樹茂費洪寶（430022 武漢，同濟醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院兒科遺傳學實驗室）參考文獻1Judith G. CATCH22. J Med Genet, 1993, 30801-802.2Wilson DI, Go

10、odship JA, Burn J, et al. Deletions within chromosome 22q11 in familial congenital heart disease. Lancet, 1992, 340573-575.3Godmuntz E, Driscoll DA, Budarf ML, et al. Microdeletions of chromosomal region 22q11 in patients with congenital conotruncal cardiac defects. J Med Genet, 1993, 30807-812.4Driscoll DA, Salvin J, Sellinger B, et al. Prevalence of 22q11 microdeletions in DiGeorge and velocardiofacial syndrome: Implications for genetic counselling and prenatal diagnosis. J Med Genet, 1993, 30813-81