原位反轉(zhuǎn)錄PCR檢測慢性丙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞中HCV

1、    原位反轉(zhuǎn)錄PCR檢測慢性丙型肝炎 患者外周血單個核細(xì)胞中HCV        【摘要】 目的 研究慢性丙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中丙型肝炎病毒的定位分布及復(fù)制。方法 直接原位反轉(zhuǎn)錄-PCR(標(biāo)記引物)對20例慢性丙型肝炎患者的PBMC內(nèi)丙型肝炎病毒(HCV)的分布、定位及存在形式進(jìn)行研究。結(jié)果 16例患者外周血單個核細(xì)胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)HCV RNA陽性信號，并有一例患者的胞漿內(nèi)

2、發(fā)現(xiàn)HCV RNA負(fù)鏈信號。結(jié)論 HCV可感染PBMC并在其中復(fù)制。原位RT-PCR為進(jìn)一步研究HCV進(jìn)入人體內(nèi)的分布、潛伏、復(fù)制狀況以及丙型肝炎治療、藥物研究奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】 丙型肝炎病毒 原位反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng) 外周血單個核細(xì)胞DETECTION OF HEPATITIS C VIRUS IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C BY IN SITU REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION Cai Meishun, Fen

3、g Baifang, Liu Yulan. Institute of Hepatology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044【Abstract】 Objective To detect the localization, distribution, replication of HCV in PBMCs of patients with chronic hepatitis. Method Direct in situ RT-PCR with labelled primer. Results In

4、 20 patients, 16(80%) were found positive for HCV genome within their PBMCs by in situ RT-PCR, and 1 patient was detected HCV RNA negative strand. These positive signals were localized in cytoplasma of PBMCs. Conclusion PBMCs could be an important extrahepatic site of virus replication. The destribu

5、tion, localization, latent replication of HCV in bodies of patients and effect of anti-viral drug might be studied by in situ RT-PCR. HCV persisted in PBMCs can interfere with the immunologic mechanism of the patient and play a role in the pathogenic progress.【Key words】 HCV In Situ RT-PCR PBMC丙型肝炎病

6、毒(HCV)感染人體后，體內(nèi)血清中的病毒含量很低，外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)內(nèi)的病毒含量可能更低，采用傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)及原位雜交技術(shù)對細(xì)胞內(nèi)低復(fù)制的病毒，進(jìn)行定位研究很不敏感。利用直接原位RT-PCR技術(shù)對慢性丙型肝炎患者的PBMC內(nèi)HCV的分布、復(fù)制狀況及其基因型進(jìn)行了研究與探討。資料與方法一、資料1. 標(biāo)本：慢性丙型肝炎患者20例，其中17例血清抗-HCV及HCV RNA均陽性，3例抗-HCV陽性，診斷符合1995年5月修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以健康正常人(獻(xiàn)血員)抗凝血為陰性對照。2. 酶與試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)、

7、DNA聚合酶(Taq-p)、無RNA酶的DNA酶(Promega公司)，RNAsin及RNaseA(華美生物工程公司)，蛋白酶K(Merk公司)，堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素(SA-AP，Vector Laboratory Inco公司), dNTP(BM公司)，BCIP、NBT(Serva公司)。3. 引物：套式引物選自HCV的5'-UCR序列如下：P1(+) 5'-CTG TGA GGA ACT ACT GTC TT-3'P2(-) 5'-CAA GCA CCC TAT CAG GCA GT-3'P3(+) 5'-GGC GTT AGT ATG

8、AGT GTCGT-3'P4(-) 5'-Bio-GCC CAA ATC TCC AGG CAT TG-3'引物P4的5'末端用生物素標(biāo)記，由北京賽百盛(美國)生物工程公司合成并標(biāo)記，原位RT-PCR與液相RT-PCR所用的引物均相同。4. 原位PCR擴(kuò)增儀PTC-100，載玻片，MJ Re-search, Inc。二、實(shí)驗(yàn)方法1. 生物素標(biāo)記引物(P4)顯色靈敏度的測定參照文獻(xiàn)1進(jìn)行。2. 密度梯度離心法分離PBMC：密度梯度離心法常規(guī)分離PBMC，然后離心洗滌4次，留取末次洗滌液及細(xì)胞懸液(2×109/L)行液相RT-PCR，余下細(xì)胞涂片。3. 直

9、接原位RT-PCR方法測定PBMC中的HCV，所用方法參照文獻(xiàn)27并作適當(dāng)修改。4. 實(shí)驗(yàn)對照：健康人的PBMC作為陰性對照，省去逆轉(zhuǎn)錄酶的對照和引物的對照，用RNase A消化陽性標(biāo)本的對照，用未標(biāo)記引物代替標(biāo)記引物的對照。5. 血漿及PBMC中的HCV基因5'非編碼區(qū)酶切基因分型方法參照文獻(xiàn)8進(jìn)行。結(jié) 果一、標(biāo)記引物顯色靈敏度測定結(jié)果顯色結(jié)果顯示此標(biāo)記引物的顯色靈敏度可達(dá)2pg(0.31 fmol)。二、原位RT-PCR結(jié)果20例慢性丙型肝炎患者中，有16例患者的PBMC可見HCV RNA正鏈陽性信號，其中一例可見HCV RNA負(fù)鏈陽性信號，陽性信號均位于細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)未見明顯

10、異常，所設(shè)置的對照均為陰性。三、血漿及PBMC內(nèi)HCV基因5'非編碼區(qū)酶切分型結(jié)果17例血漿HCV RNA陽性的患者酶切后有16例無Hae酶切位點(diǎn)(HCV型)，1例酶切后出現(xiàn)145bp、89bp、56bp三段(HCV型)。20例PBMC內(nèi)HCV RNA陽性的患者，酶切后發(fā)現(xiàn)有18例無Hae酶切位點(diǎn)(HCV型)，2例酶切后出現(xiàn)145bp、89bp、56bp三段(HCV型)。血漿及PBMC內(nèi)HCV基因5'非編碼區(qū)酶切分型結(jié)果一致。討 論實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了PBMC中HCV的存在，對HCV在PBMC內(nèi)進(jìn)行定位研究，發(fā)現(xiàn)HCV RNA陽性信號位于PBMC的細(xì)胞漿中，被HCV感染的PBMC的

11、形態(tài)未見異常，這也和最近Muratori等9首次利用此方法在PBMC內(nèi)檢測HCV RNA的結(jié)果一致。在實(shí)驗(yàn)過程中過度的蛋白酶消化不僅會破壞細(xì)胞的形態(tài)，而且也易引起細(xì)胞的脫片；用DNA酶預(yù)處理也是必要的，可降低背景、減少非特異性擴(kuò)增。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)選擇2.5mmol/L的鎂離子的濃度較適宜，這可能與鎂離子與組織內(nèi)某些結(jié)構(gòu)結(jié)合的緣故。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HCV RNA的陽性信號存在于PBMC的胞漿內(nèi)，且1例可見HCV RNA負(fù)鏈陽性信號，表明HCV確實(shí)可感染PBMC并在其中復(fù)制。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多組對照并采用了套式標(biāo)記引物，以提高反應(yīng)的特異性，說明標(biāo)記引物的直接原位PCR技術(shù)所得的結(jié)果相對來說是可靠的，可以考慮

12、推廣使用并在使用中改正其缺點(diǎn)不斷完善發(fā)展。本課題受國家自然科學(xué)基金資助(批準(zhǔn)號：39500123)作者單位：100044北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所參 考 文 獻(xiàn)1 王申五主編. 基因診斷技術(shù)非放射性操作手冊. 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社. 1992年，第1版.2 Bagasra O, Hauptman SP, Lischner HW, et al. Detection of HIV-1 provirus in mononuclear cells by in situ PCR. New Engl J Med, 1992, 326: 1385.3 Bagasra O, Sesham

13、man T, Pomerrants RJ. Polymerase chain reaction in situ: intracellular amplification and detection of HIV-1 proviral DNA and other specific genes. J Immunol Methods, 1993, 158: 131.4 Nuovo GJ, Forde A, MacConnell P, et al. In situ detection of PCR HIV-1 nucleic acid and tumor necrosis factor cDNA in

14、 cervical tissue. AM J Pathol, 1993, 143: 40.5 Nuovo GJ, Lidonnici K, MacConnell P, et al. Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR) amplified hepatitis C cDNA. AM J Surgi Pathol, 1993, 17: 683.6 Chen RH, Fuggle SV. In situ cDNA polymerase chain reaction: a novel technique for detecting mRNA express. AM J Pathol, 1993, 143: 1527.7 劉玉蘭，杜紹財，陶其敏. 石蠟包埋肝組織中丙型肝炎病毒的原位PCR研究. 中華病理學(xué)雜志，1996，25: 27.8 杜紹財，陶其敏，朱凌，等. 丙型肝炎病毒基因5'非編碼區(qū)酶切分型. 中華醫(yī)學(xué)雜志，1993，73：7.9 Muratori L, Gibell