溶膠-凝膠植物組織生物傳感器研究

1、溶膠-凝膠植物組織生物傳感器研究李敏健 蔡沛祥*基金項(xiàng)目 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào):02017)資助第一作者 李敏健(1981年出生),女,中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院應(yīng)用化學(xué)專業(yè)99級(jí)指導(dǎo)教師 蔡沛祥 Email: caipx中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 廣州 510275摘要 本文將溶膠-凝膠與植物組織液汁混合,實(shí)現(xiàn)了對(duì)天然存在的酶的固定化,由此形成生物傳感器的敏感膜.利用涂滴于鉑盤電極表面的Nafion膜提高傳感器的選擇性,制備成Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠電催化型多巴胺生物傳感器.采用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法考察了傳感器的電化學(xué)特性,采用差示脈沖伏

2、安法對(duì)多巴胺進(jìn)行定量分析,線性范圍為2×10-61×10-4mol/L,檢出限為8.0×10-7mol/L.該傳感器制備方法簡(jiǎn)單,靈敏度高,且具有良好的選擇性.結(jié)果表明,所提出的關(guān)于生物材料固定新方法可行,與傳統(tǒng)方法相比具有特色.關(guān)鍵詞 溶膠-凝膠,植物組織,酶電極,生物傳感器,多巴胺中圖分類號(hào):0629 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A溶膠-凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其孔徑大小可人為調(diào)控,且實(shí)驗(yàn)條件溫和,具備微水環(huán)境的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),很適合作為生物分子的載體.因此,溶膠-凝膠是對(duì)生物分子固定化的優(yōu)良材料.近年在生物傳感器研究領(lǐng)域中很受重視1-4.其中目前國(guó)內(nèi)外研究最多的是利用溶膠-凝膠對(duì)酶

3、進(jìn)行包埋,研制成各種酶電極用于測(cè)定葡萄糖5、過氧化氫6、氨基酸7等.文獻(xiàn)上的酶電極是利用純酶進(jìn)行研制,純酶提取的工藝復(fù)雜,價(jià)格昂貴,應(yīng)用上受到限制.天然植物中存在豐富的酶源,如果能利用這種價(jià)廉物美、取之不盡的生物材料制作傳感器,就很有實(shí)際意義.但目前尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)于采用溶膠-凝膠技術(shù)固定天然植物組織中的酶制成傳感器的報(bào)道.本文提出把植物組織液汁與溶膠-凝膠結(jié)合制備生物傳感器的方法,無(wú)需對(duì)酶分離提取即可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物組織中酶的固定化,研制成對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺具有選擇性響應(yīng)的電流型生物傳感器,通過對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定,證實(shí)本方法的可行性.1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器與試劑CHI 750A型電化學(xué)工作站(上

4、海辰華儀器公司);超聲波清洗器(明珠電器有限公司)正硅酸乙酯(TEOS, Aldrich公司);Triton X-100(Research公司);Nafion-117(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的乙醇溶液,Fluka公司);鹽酸多巴胺(DA, Sigma公司);鹽酸多巴胺注射液(江蘇林海藥業(yè)有限公司制造分公司);鹽酸腎上腺素注射液(EP,廣州明興制藥廠);重酒石酸去甲腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司);抗壞血酸(維生素C藥片,AA,廣東華南制藥廠);0.1mol/L Na2HPO4-0.1mol/L KH2PO4緩沖溶液(PBS, pH=7.4)為測(cè)試底液;所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.1.2

5、二氧化硅溶膠-凝膠的制備將60L TEOS、410L水、12L 0.1mol/L HCL和20L Triton X-100混合,室溫下超聲振蕩1h,使其形成均勻澄清的溶膠,然后室溫放置23h.使用前用0.01mol/L NaOH調(diào)至pH7.4.1.3 多巴胺傳感器的制備將鉑盤電極(1mm)在金相砂紙上打磨拋光,依次在HNO3(1:1)、丙酮和雙蒸水中超聲清洗15min,清洗后的電極置于室溫下晾干備用.用微量注射器將5L含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% Nafion的乙醇溶液滴涂于電極表面,室溫下晾干備用.按一定比例將蘋果汁與上述溶膠混合,超聲振蕩均勻.用微量注射器吸取5L蘋果汁溶膠-凝膠，滴涂于已經(jīng)Nafio

6、n修飾的鉑盤電極表面,室溫下晾干待用.1.4 實(shí)驗(yàn)方法采用三電極系統(tǒng),以所研制的多巴胺傳感器為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為對(duì)電極;以0.1mol/L Na2HPO4-0.1mol/L KH2PO4緩沖溶液(PBS, pH=7.4)為測(cè)試底液;采用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法研究傳感器的電化學(xué)特性,采用差示脈沖伏安法對(duì)DA進(jìn)行定量分析.除另有說明外,電位掃描的范圍是0.6V-0.2V,掃描速度是100mV/s,多巴胺溶液的濃度是1.05×10-3mol/L;進(jìn)行定量分析時(shí),預(yù)先在0.6V下停留30秒才進(jìn)行電位掃描.圖1 多巴胺伏安圖a Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾

7、電極對(duì)DA的響應(yīng)b蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)DA的響應(yīng)c不含植物組織的溶膠-凝膠電極對(duì)DA的響應(yīng)d裸電極對(duì)DA的響應(yīng)e Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在PBS底液中2 結(jié)果與討論2.1 酶的催化作用及傳感器的電化學(xué)特性用Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極和蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)多巴胺溶液進(jìn)行循環(huán)伏安法電位掃描時(shí),得到氧化還原電流峰(圖1a,b);而不含植物組織的溶膠-凝膠電極和裸電極所產(chǎn)生的i-E曲線顯得平緩(圖1c,d);用Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極對(duì)PBS底液進(jìn)行掃描時(shí)得到的i-E曲線也顯得平緩(圖1e).說明了蘋果組織中的酶確實(shí)對(duì)多巴胺的電化學(xué)過程起

8、催化作用;Nafion膜和溶膠-凝膠膜負(fù)電性的結(jié)構(gòu)也有利于與多巴胺的接觸,使傳感器對(duì)多巴胺的催化作用增強(qiáng).植物組織中含有多酚氧化酶,它能催化多巴胺的電化學(xué)氧化:圖2 掃描速度(v)與響應(yīng)電流ipc的關(guān)系所生成的醌式化合物能在電極表面吸附富集,當(dāng)進(jìn)行陰極電位掃描時(shí),該醌式化合物在電極表面進(jìn)行還原.多巴胺分子結(jié)構(gòu)中的2個(gè)酚羥基是電活性基團(tuán),因此該CV曲線是2電子/2質(zhì)子的準(zhǔn)可逆氧化還原過程.為了研究響應(yīng)電流的性質(zhì),考察了不同掃描速度(v)對(duì)峰電流(ipc)的影響.結(jié)果表明,掃描速度在50200mV/s的范圍內(nèi),還原峰電流與電位掃描速度的平方根的關(guān)系曲線為向電流（ipc）軸上翹的曲線(圖2),這是吸

9、附電流的特征.進(jìn)一步考察了電位掃描前在0.6V下停留時(shí)間的影響.結(jié)果表明,響應(yīng)電流隨停留時(shí)間的延長(zhǎng)而增加.這進(jìn)一步表明響應(yīng)電流具有吸附特性.停留時(shí)間至30s時(shí),響應(yīng)電流達(dá)最大值.故本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行定量分析時(shí)采用的停留時(shí)間為30s.2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇2.2.1 pH的選擇從實(shí)際應(yīng)用出發(fā),以選擇接近人體pH值的條件為宜;實(shí)驗(yàn)也表明,多巴胺的測(cè)定在pH7.4時(shí)靈敏度較高.故本實(shí)驗(yàn)采用pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液作為介質(zhì).2.2.2 植物組織的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):番茄、紫荊花、白菜、琵琶果、土豆、龍船花、蘋果均含有能對(duì)多巴胺的電化學(xué)氧化起催化作用的多酚氧化酶,其中以蘋果作為生物催化劑的效果最佳(表1).進(jìn)一步

10、比較了香蕉蘋果和富士蘋果的外層、中層、內(nèi)層果肉的催化效果(表2).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富士蘋果各部位的催化效果皆優(yōu)于香蕉蘋果各相應(yīng)部位;對(duì)于同一品種蘋果,外層果汁、中層果汁、內(nèi)層果汁制得的修飾電極的響應(yīng)峰電流ipc依次增大,說明其相應(yīng)部位所含的多酚氧化酶依次增多.故確定以富士蘋果內(nèi)層果肉的液汁作為本實(shí)驗(yàn)的生物催化劑.表1 不同植物品種的催化效果比較植物種類 ipc/A番茄 2.588E-07紫荊花 3.475E-07白菜 3.926E-07琵琶果 4.218E-07土豆 6.358E-07龍船花 1.147E-06蘋果 1.385E-06表2 蘋果中不同部位催化效果比較蘋果的不同部位 ipc/A香蕉蘋果外

11、層 5.194E-07香蕉蘋果中層 8.915E-07香蕉蘋果內(nèi)層 1.096E-06富士蘋果外層 7.953E-07富士蘋果中層 8.917E-07富士蘋果內(nèi)層 2.383E-06表3 乙醇加入量對(duì)傳感器性能的影響乙醇加入量/L ipc/A0 2.412E-0720 1.402E-0740 1.474E-072.2.3 溶膠-凝膠配比的選擇表4 水酯比對(duì)傳感器性能的影響R ipc/A4 7.637E-075 8.811E-076 1.042E-067 1.291E-068 1.184E-069 1.357E-0610 9.634E-07考慮到乙醇作為有機(jī)溶劑,有可能對(duì)植物組織中的多酚氧化酶的

12、活性有影響.首先對(duì)是否加入乙醇進(jìn)行研究(表3).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):不加乙醇的溶膠,振蕩至澄清所需的時(shí)間較不加乙醇的溶膠長(zhǎng),制得的修飾電極的響應(yīng)峰電流ipc較大.說明了乙醇起到了促進(jìn)溶膠形成的作用但不利于多酚氧化酶活性的保持。表5 蘋果汁用量對(duì)傳感器性能的影響蘋果汁加入量（占溶膠的比例） ipc/A二分之一 5.580E-07三分之一 7.329E-07四分之一 8.578E-07五分之一 1.039E-06六分之一 1.779E-06八分之一 1.234E-06十分之一 9.668E-07本文又研究了在固定蘋果汁的加入量的條件下,水酯比(R)的確定(表4).實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)R=9時(shí),響應(yīng)峰電流ipc較大.

13、這是因?yàn)楫?dāng)水與硅酯的比值大于4時(shí),能加速硅酯鍵的水解,易形成分子量大的網(wǎng)狀聚合物,聚合物的空隙度和比表面積較大,這類聚合物對(duì)生物活性物質(zhì)的包埋與固定有利;當(dāng)R4時(shí),硅酯鍵水解不充分,易形成分子量小、鏈狀的聚合物,此時(shí)聚合物的網(wǎng)孔較小,不利于酶或蛋白質(zhì)的固定.因此本文確定溶膠的配制不加乙醇,且水酯比為9.2.2.4 溶膠-凝膠膜中蘋果汁包埋量的選擇傳感器敏感膜中酶的含量是影響傳感器性能的關(guān)鍵因素.實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)溶膠-凝膠中蘋果汁含量較少時(shí),催化作用不明顯,響應(yīng)峰電流ipc較低;蘋果汁含量過高時(shí),使電極內(nèi)阻增大,不利于伏安測(cè)定(表5).因此本實(shí)驗(yàn)選擇合適的蘋果汁含量為蘋果汁:溶膠總量=1:6,這時(shí)測(cè)

14、量的靈敏度較高,有利于多巴胺的定量測(cè)定.2.3 傳感器的選擇性圖4 修飾電極對(duì)AA的響應(yīng)a-蘋果汁-溶膠-凝膠電極對(duì)AA的響應(yīng)b-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠電極對(duì)AA的響應(yīng)圖3 修飾電極在DA、DA與AA混標(biāo)中溶液的響應(yīng)a-蘋果汁-溶膠-凝膠電極對(duì)DA的響應(yīng) b-蘋果汁-溶膠-凝膠電極在DA和AA混標(biāo)溶液中的響應(yīng)c-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠電極在DA和AA混標(biāo)溶液中生物樣品中的抗壞血酸(AA)是對(duì)多巴胺檢測(cè)的主要干擾組分(圖3).本實(shí)驗(yàn)利用Nafion膜內(nèi)負(fù)電性的磺酸基(SO3-)與溶液中陰離子的相互排斥作用,達(dá)到排除干擾的目的.實(shí)驗(yàn)表明,本文研制的傳感器(Nafion-蘋果汁-

15、溶膠-凝膠修飾電極)能較好地消除AA對(duì)多巴胺檢測(cè)的干擾(圖4).圖6 修飾電極在去甲腎上腺素中的響應(yīng)a-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在去甲腎上腺素中b-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在去甲腎上腺素中圖5 修飾電極在DA、DA與EP混標(biāo)及EP中的響應(yīng)a-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在EP中b-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在EP中c-Nafion-蘋果汁-溶膠-凝膠修飾電極在DA和EP混標(biāo)中腎上腺素和去甲腎上腺素與多巴胺同屬于神經(jīng)遞質(zhì),實(shí)驗(yàn)表明,本傳感器也能較好地排除腎上腺素(圖5)和去甲腎上腺素(圖6)對(duì)多巴胺檢測(cè)的干擾.2.4多巴胺的定量測(cè)定圖7 傳感器對(duì)不同濃度DA的DPV

16、響應(yīng)CDA(mol/L):a.6×10-6,b.8×10-6,c.1×10-5,d.2×10-5,e.4×10-5,f.6×10-5,g.8×10-5,h.1×10-4采用差示脈沖伏安法(DPV)陰極掃描對(duì)DA進(jìn)行定量檢測(cè)(圖7).結(jié)果表明,在2×10-61×10-4mol/L范圍內(nèi),DA的陰極峰電流與其濃度成良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:I(A)=0.321+4.29×C(mmol/L),R=0.999,方法的檢出限為8.0×10-7mol/L.采用差示脈沖伏安法對(duì)多巴胺

17、針劑的DA含量進(jìn)行分析(表6),測(cè)定結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)示值吻合.表6 對(duì)多巴胺針劑中的DA含量分析DA的測(cè)定值(mg/mL) DA的標(biāo)準(zhǔn)值(mg/mL) RE（%）0.0103 0.0100 3.02.5 結(jié)論本文利用溶膠-凝膠技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然植物組織中酶的固定化,與傳統(tǒng)的組織電極8(包括切片組織電極和碳糊組織電極)相比,具有如下特色:1.以往的切片組織電極需與特定的基礎(chǔ)電極(如O2電極、NH3電極等)組合,還需要透氣膜及外層保護(hù)網(wǎng)等構(gòu)成,制作復(fù)雜.而本傳感器的基礎(chǔ)電極僅是簡(jiǎn)單的鉑盤電極,對(duì)電極的修飾過程方便、快捷.2.克服了碳糊組織電極中酶容易從電極表面流失以及碳糊容易脫落、經(jīng)不起溶液攪拌的弊病.3

18、.便于采用復(fù)合修飾膜(如Nafion膜等)以提高傳感器性能(如抗干擾能力、協(xié)同催化作用等).因此,基于溶膠-凝膠技術(shù)的植物組織傳感器是對(duì)傳統(tǒng)組織電極的一個(gè)革新.致謝 感謝中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)基金對(duì)本課題研究的支持.參 考 文 獻(xiàn)1 Shaojun Dong, Xu Chen. Some new aspects in biosensors. Molecular Biotechnology, 2002,82:303-3232李清文,王義明,羅國(guó)安.溶膠凝膠技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用.化學(xué)通報(bào),2000,(5):14-193張宇,陳年友,朱龍根.溶膠-凝膠法固定生物活性物質(zhì)的研

19、究進(jìn)展.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2000,21(5):675-6804王炳全,程廣金,董紹俊.溶膠凝膠生物傳感器.分析化學(xué),1999,27(8):982-9885 Wang B, Li B, Dong S. Amperometric Glucose biosensor based on sol-gel organic-inorganic hybrid material. Anal.Chem. 1998,70,3170-31746 Chex X, Wang B, Dong S. Amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on sol-gel/

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21、dy On Sol-gel-coated Plant Tissue BiosensorLI Min-jian, CAI Pei-xiang*(School of Chemistry and Chemical Engineering, SunYat-sen University, Guangzhou 510275 China)Abstract SiO2 sol-gel is used to coat crude enzyme from botanic juice to prepare the sense organ of the biosensor. The dopamine electroca