鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素對CCD大鼠脊髓突觸重塑的影響

1、鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素對CCD大鼠脊髓突觸重塑的影響*    【摘要】  目的 研究鞘內(nèi)注射(i.t.)氟代檸檬酸（FC）和米諾四環(huán)素(MC)對背根節(jié)慢性壓迫模型(CCD)大鼠脊髓背角突觸重塑的影響。方法 采用大鼠CCD模型，48只鞘內(nèi)置管SD大鼠隨機分為六組：sham組（假手術(shù)組），CCD組，PBS（溶劑磷酸鹽緩沖生理鹽水）組（0.01 mmol/L PBS 20 l，i.t.），F(xiàn)C組（1 mol/L FC 20 l，i.t.），MC組(5 g/L MC 20 l，i.t.)，F(xiàn)C+MC組(1 mol/L FC和5 g/L MC混合

2、液 20 l，i.t.)。術(shù)后每天給藥1次，第14天處死，采用免疫組織化學方法和電鏡技術(shù)觀察大鼠脊髓背角突觸數(shù)目和突觸后致密物厚度的變化。結(jié)果鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素第14天，大鼠脊髓背角P38陽性表達FC+MC組明顯抑制（P0.01），sham組次之（P0.05），余下四組差異無顯著性；電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示CCD組、 PBS組、FC組、MC組脊髓背角突觸結(jié)構(gòu)明顯增厚，sham組有增厚不明顯（P0.05），F(xiàn)C+MC組增厚不明顯（P0.01）。結(jié)論鞘內(nèi)給藥后，在本實驗劑量下，小膠質(zhì)細胞抑制劑米諾四環(huán)素比星形膠質(zhì)細胞抑制劑氟代檸檬酸更好地抑制了大鼠的慢性疼痛。鞘內(nèi)同時注射氟代檸檬酸和米諾

3、四環(huán)素可抑制大鼠脊髓背角突觸結(jié)構(gòu)的增厚。 【關(guān)鍵詞】  脊 鞘內(nèi)注射 膠質(zhì)細胞抑制劑 米諾四環(huán)素 氟代檸檬酸 背根節(jié)慢性壓迫 突觸 大鼠    Effects on intrathecal administration of fluorocitrate or minocycline on synapsis remodeling of spinal cord in CCD rats      Abstract  Objective  To study the effects of intrathecal i

4、njecting(i.t.) two specieses glia cell metabolic inhibitor fluorocitrate(FC) and minocycline(MC) and phosphate buffered saline(PBS) on synapsis remodeling of spinal cord in chronic compression of dorsal root ganglia (CCD) rats.Methods  48 SD rats with intrathecal catheter insertion and checkout

5、ed by lidocaine experiment randomly was divided into six groups (n=8) which included sham group,CCD group (received chronic compression of right dorsal root ganglion),PBS group (0.01 mmol/L PBS 20 l,i.t.),FC group(1 mol/L fluorocitrate 20 l,i.t.),MC group(5g/L minocycline 20 l,i.t.),FC + MC group(th

6、e mixture of 1mol/L fluorocitrate and 5g/L minocycline 20 l,i.t.).Sacrifice on the 14th day of CCD was done,expression of the P38 was detected in the spinal dorsal horn on the 14th postoperative day rats by immunohistochemistry techniques,at the same time,the synaptic structure remodeling of those r

7、ats using electromicroscope methods were observed.Results  The expression of P38 showed that FC+MC group  obviously suppressed(P0.01),sham group was secondary(P0.05) and the rest was no visibly difference in the spinal dorsal horn(P>0.05).The trend was that the synaptic structure was th

8、ickening in the spinal dorsal horn under the electromicroscope coincident with the expression of P38.Conclusion  After intrathecal administration,minocycline of microglia inhibitor can attenuate better the chronic pain of CCD rats rather than fluorocitrate of astrocyte's.Intrathecal injecti

9、on of fluorocitrate with minocycline can prevent the synaptic structure thickening in the spinal dorsal horn in CCD rats.     Key words  spinal cord;intrathecal injection;metabolic inhibitor of neuroglia;minocycline;fluorocitrate;chronic compression of dorsal root ganglion;synaps

10、is remodeling;rats     傳統(tǒng)的觀點認為神經(jīng)膠質(zhì)細胞僅是對神經(jīng)元起支持和營養(yǎng)作用，而不具有細胞間的信號傳遞功能。然而隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)證明，脊髓膠質(zhì)細胞（主要是星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞）的激活參與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的重塑，形成有完整功能的突觸13，介導痛覺過敏的產(chǎn)生和痛覺的持續(xù)狀態(tài)3,4。本研究在大鼠背根神經(jīng)節(jié)壓迫模型（chronic compression of dorsal root ganglion,CCD）上，通過鞘內(nèi)注射(intrathecal injecting，i.t.)星形膠質(zhì)細胞代謝抑制劑氟代檸檬酸(fluoroci

11、trate,FC)、小膠質(zhì)細胞代謝抑制劑米諾四環(huán)素 (minocycline,MC)，觀察大鼠行為學和突觸后致密物的厚度改變，了解膠質(zhì)細胞代謝抑制劑對CCD大鼠脊髓突觸重塑的影響。     1  材料和方法     1.1  藥品和儀器  米諾四環(huán)素 （Sigma公司，美國），氟代檸檬酸（Sigma公司，美國），PE-10導管（上海），微量進樣器（上海），Von Frey 纖維絲（Stolting公司，美國），熱痛刺激儀BME-410A(中國醫(yī)學科學院生物工程研究所)，電鏡照相系統(tǒng)T-600型（日本國株式

12、會社日立制作所）。     1.2  動物與分組  雄性SD大鼠 48只（徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供），體重200250 g，腹腔注射戊巴比妥40 mg/kg 后，按Yaksh法5鞘內(nèi)置管，置管后無運動障礙且經(jīng)利多卡因試驗證實導管在鞘內(nèi)，隨機分為sham組（假手術(shù)組）、 CCD（背根神經(jīng)節(jié)壓迫模型）組、PBS（溶劑磷酸鹽緩沖生理鹽水）組（0.01 mmol/L PBS 20 l，i.t.）、 FC組（1 mol/L FC 20 l，i.t.）、MC組(5 g/L MC 20 l，i.t.)、FC+MC組(1 mol/L FC和5 g/L MC混

13、合液20 l，i.t.)，每組8只。保持動物在室溫20 ±2 ，晝夜節(jié)律，自然飲水、進食，每天上午9點鞘內(nèi)注射。鞘內(nèi)給藥于手術(shù)當天進行，各組于CCD術(shù)后第14天處死，取腰骶段脊髓膨大處CCD側(cè)背角1 mm×1 mm×1 mm，立即置于2.5%的戊二醛中，4 冰箱保存?zhèn)溆谩?    1.3  病理性神經(jīng)痛模型的建立   鞘內(nèi)置管第5天,參照胡三覺等6方法，在戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉SD大鼠后，沿L4L6 脊椎右側(cè)切皮，分離脊椎右側(cè)肌肉，暴露L4、L5橫突和椎間孔，用彎成直角的長3.5 mm,直徑

14、0.7 mm的鋼絲，以與背部正中線成30°以及與脊椎側(cè)面水平線成10°向頭背端插入L4和L5椎間孔，當鋼絲碰到背根節(jié)或者神經(jīng)根時同側(cè)后肢抽動，適當調(diào)整鋼絲的位置，使其形成對L4和L5背根節(jié)穩(wěn)定的壓迫，最后分層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組僅暴露L4、L5橫突和椎間孔，不插入鋼絲。術(shù)后每天腹腔注射40萬 u青霉素1次，連續(xù)3天，預防切口感染。剔除手術(shù)后肢體癱瘓的動物。     1.4  檢測方法     1.4.1  免疫組織化學方法  大鼠在戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉下行左心

15、室穿刺，生理鹽水200 ml快速灌注，繼之以預冷的4%的多聚甲醛350 ml先快后慢灌注約30 min。取L3L5脊髓段1 cm，置于4%多聚甲醛后固定6 h，然后移入20%的蔗糖（4 ）過夜。次日，取脊髓做冰凍冠狀連續(xù)切片，片厚20 m。SP法免疫組織化學染色，DAB顯色:切片用PBS液沖洗后，在3%的過氧化氫處理10 min后，用5%的封閉血清在室溫孵育30 min，加入稀釋過的小鼠抗P38(Sigma公司，1200) 一抗，4 孵育24 h,順序加入SP試劑盒的生物素化二抗工作液和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，以上各步驟均用0.01 mmol/L PBS徹底漂洗切片，最后用即用型DAB顯色

16、，在顯微鏡下觀察反應程度，再用0.01 mmol/L PBS及時終止反應，顯色后的切片裱于涂有明膠的載玻片上，干燥、脫水、透明，中性樹膠封片。     1.4.2  電子顯微鏡技術(shù)方法  切片制備：各組大鼠行為學實驗后（術(shù)后第7天和第14天），大鼠均在腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）深麻醉下迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管，先以100 ml生理鹽水沖凈血液，隨即以預冷的4多聚甲醛，0.1 mmol/L磷酸緩沖液（PB，pH 7.4）500 ml先快后慢灌注約1 h，取腰骶段脊髓膨大處CCD側(cè)背角1 mm×1 mm×1

17、mm，立即置于2.5%的戊二醛中4 冰箱保存?zhèn)溆?。電鏡觀察：將所取脊髓組織1 mm×1 mm×1 mm 浸于2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.2）固定48 h。1%的四氧化鋨后固定1 h，丙酮逐級脫水，包埋（包埋劑的配制：環(huán)氧樹脂 812815DDSADMP-30=2.52.580.175）。LKB-5超薄切片機切片，厚度為50 nm。醋酸鈾染色，日立H-600型電子顯微鏡照相。     1.5  突觸攝片計數(shù)  免疫組織化學方法每只動物每個指標隨機取脊髓片3張，高倍鏡下以Olympus DP11數(shù)碼相機在背角截取一屏計

18、數(shù)。電鏡技術(shù)在日立H-600型電子顯微鏡下，借助Motic Images Advanced 3.0 圖像分析系統(tǒng)測量突觸后膜致密物的厚度。     1.6  統(tǒng)計學方法  所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及SNK法，與基礎(chǔ)痛閾比較采用配對t檢驗，用SPSS 11.5軟件進行處理，P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。    2  結(jié)果     2.1  鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素第14天脊髓背角P38的表

19、達  鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素第14天脊髓背角P38染色的突觸數(shù)目sham組明顯比CCD組、PBS組、FC組和MC組少(P0.01)，顯著多于 FC+MC組 (P0.01)。CCD組、PBS組、FC組和MC組四組間差異無顯著性（P>0.05）。見圖1、圖3。     2.2  鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素CCD大鼠電鏡下脊髓背角突觸后致密物厚度的變化  鞘內(nèi)注射米諾四環(huán)素和氟代檸檬酸第14天CCD大鼠脊髓背角突觸后致密物厚度，CCD組對比sham組和FC+MC組顯著增厚(P0.01),和PBS 組、FC組、MC組比較無統(tǒng)

20、計學差異(P>0.05)。sham組和FC+MC組突觸前膜、突觸后膜和突觸間隙清晰，突觸終末有較多清亮的圓形囊泡；CCD組、PBS組、FC組和MC組部分突觸突起融合，突觸前膜和突觸后膜致密物增厚，密度增大，突觸間隙模糊不清。見圖2、圖4。     3  討論     長期以來，人們認為突觸的形成只和神經(jīng)元有關(guān)，但近來越來越多的實驗表明，星形膠質(zhì)細胞在突觸重塑過程中發(fā)揮著重要作用。     本實驗研究應用免疫組織化學方法對鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素第14天的CCD大鼠觀察了P38（突觸囊

21、泡素）標記的大鼠脊髓背角突觸數(shù)目，結(jié)果顯示單獨鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸或者米諾四環(huán)素的FC組和MC組與CCD組及PBS組沒有顯著差異，同時鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素的FC+MC組突觸數(shù)目顯著減少；同時在電鏡下對鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸和米諾四環(huán)素第14天的CCD大鼠觀察發(fā)現(xiàn)CCD組、PBS組、FC組和MC組突觸后致密物的厚度明顯增厚，部分突觸突起融合、密度增大、突觸間隙模糊不清。sham組和FC+MC組突觸后致密物增厚不明顯，突觸前膜、突觸后膜和突觸間隙清晰，突觸終末有較多清亮的圓形囊泡。這一結(jié)果提示單獨鞘內(nèi)注射膠質(zhì)細胞抑制劑沒有完全抑制膠質(zhì)細胞的活化和突觸的傳遞；當同時鞘內(nèi)注射星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細

22、胞抑制劑時突觸傳遞發(fā)生障礙，突觸數(shù)目也有明顯減少，有可能2種膠質(zhì)細胞活化被抑制導致突觸重塑障礙。在星形膠質(zhì)細胞或者小膠質(zhì)細胞單獨被抑制時，一方能否代償另一方在突觸重塑中的作用，尚待進一步的研究。     神經(jīng)元軸突終末、樹突和胞體及星形膠質(zhì)細胞的突起共同構(gòu)成三重突觸結(jié)構(gòu)（tripartite synapses）7，8。星形膠質(zhì)細胞包圍著神經(jīng)末梢，不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動，而且能影響突觸的傳遞，對正常突觸的形成和維持突觸的穩(wěn)定有重要作用，星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間存在復雜的相互作用。在病理條件下，新生的神經(jīng)元雖然已具備了形成突觸的基本條件，但只有在膠質(zhì)細胞存在的環(huán)境下才

23、能大量形成功能性突觸，膠質(zhì)細胞不僅可以增加成熟突觸的數(shù)目，還能增加突觸的功能。近年來，隨著膜片鉗及分子生物學技術(shù)的應用，人們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞表面不僅具有電壓依賴的Na+、K+、Ca2+ 通道，而且分布許多神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、激素和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，并能合成和分泌多種神經(jīng)活性物質(zhì)，在維持神經(jīng)元內(nèi)外環(huán)境、生存、遷移、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、軸突生長、突觸重塑及功能整合等方面具有重要作用9。     小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元的生理活動中起支持、營養(yǎng)、保護及修復等重要功能，是神經(jīng)系統(tǒng)不可缺少的成分。激活的小膠質(zhì)細胞分泌生長因子、吞噬膠質(zhì)細胞碎片、抵御外來抗原10,11；同時釋放大量的

24、興奮性氨基酸、一氧化氮、前列腺素和促炎性細胞因子（TNF、IL-6、IL-1），這些物質(zhì)彌散到附近的神經(jīng)元突觸，提高神經(jīng)元的興奮性，擴大疼痛傳入的強度和范圍12。小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有營養(yǎng)保護和神經(jīng)毒性雙向作用。Hynds等的研究結(jié)果認為在脊髓損傷區(qū)移植小膠質(zhì)細胞及其分泌的因子可促進脊髓損傷后感覺神經(jīng)纖維的再生。這些結(jié)果提示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位增加激活的小膠質(zhì)細胞的數(shù)量有助于增強一些有利于生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)的分泌，提供一個有益于突觸重塑的生理環(huán)境。 【參考文獻】  1 Santina Bruzzone,Claudia Verderio.Glutamat

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