疫組化技術(shù)-理論篇ppt課件

1、免疫組織化學(xué)實(shí)際篇免疫組織化學(xué)實(shí)際篇(immunohistochemistry)免疫組化的標(biāo)志物免疫組化的標(biāo)志物 酶標(biāo)志酶標(biāo)志 膠體金標(biāo)志膠體金標(biāo)志 熒光標(biāo)志熒光標(biāo)志 放射性標(biāo)志放射性標(biāo)志免疫組化的標(biāo)志物免疫組化的標(biāo)志物 酶標(biāo)志：酶標(biāo)志：運(yùn)用最廣泛運(yùn)用最廣泛常用標(biāo)志物：常用標(biāo)志物： - -辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP): (HRP): 染色時(shí)同時(shí)加底物染色時(shí)同時(shí)加底物H2O2H2O2和供氫體和供氫體DABDAB或或AECAEC，生成棕色，生成棕色DABDAB或紅色或紅色AECAEC HRP+DAB HRP+DABH2H2+H2O2=HRP+2H2O+H2O2=HRP+2H2O+氧化型氧

2、化型DABDAB呈色呈色 - -堿性磷酸酶堿性磷酸酶(ALP)(ALP)：以萘酚：以萘酚As-MsAs-Ms磷酸鹽為底物磷酸鹽為底物，快藍(lán)，快藍(lán)FB/FB/快紅快紅FRFR為呈色劑，生成藍(lán)色為呈色劑，生成藍(lán)色/ /紅色沉淀。紅色沉淀。主要用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶多得血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞主要用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶多得血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞 免疫組化的標(biāo)志物免疫組化的標(biāo)志物膠體金標(biāo)志：膠體金標(biāo)志： 以膠體金做標(biāo)志物對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)以膠體金做標(biāo)志物對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)展定位、定量研討的方法。膠體金是的抗原進(jìn)展定位、定量研討的方法。膠體金是一種特殊的金屬顆粒，呈淡紅至深紅色，可在一種特殊的金屬顆粒，呈淡紅至深紅色，可

3、在光鏡下察看。膠體金顆粒大小不同，電子密度光鏡下察看。膠體金顆粒大小不同，電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適宜免疫電鏡察高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適宜免疫電鏡察看?？?。免疫組化的標(biāo)志物免疫組化的標(biāo)志物 熒光標(biāo)志熒光標(biāo)志: : 以熒光素做標(biāo)志物以熒光素做標(biāo)志物, ,與其相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體起反響后與其相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體起反響后, , 構(gòu)成帶有熒光素的免疫復(fù)合物上構(gòu)成帶有熒光素的免疫復(fù)合物上, ,在熒光顯微鏡下察看抗原在熒光顯微鏡下察看抗原抗體反響結(jié)合部位抗體反響結(jié)合部位, , 對(duì)組織中的抗原或抗體進(jìn)展定位，定對(duì)組織中的抗原或抗體進(jìn)展定位，定量分析。量分析。常用熒光素：常用熒光素：異硫氰酸熒光素異

4、硫氰酸熒光素Fluorescien isocynate FITCFluorescien isocynate FITC：黃綠色：黃綠色熒光熒光德克薩斯德克薩斯Texas red TRTexas red TR：鮮紅色：鮮紅色羅丹明羅丹明Rhodame TRITCRhodame TRITC紅色紅色花青花青5 5Cyanine CY5):Cyanine CY5):藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光 免疫組化標(biāo)志物免疫組化標(biāo)志物放射性標(biāo)志：放射性標(biāo)志： 運(yùn)用放射性同位素作為示蹤物，運(yùn)用放射性自運(yùn)用放射性同位素作為示蹤物，運(yùn)用放射性自顯影術(shù)對(duì)組織中的抗原進(jìn)展分析。顯影術(shù)對(duì)組織中的抗原進(jìn)展分析。 免疫組化的檢測(cè)系統(tǒng)免疫組化的

5、檢測(cè)系統(tǒng) l過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 PAPl堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶APAAPl卵白素卵白素-生物素復(fù)合物法生物素復(fù)合物法ABCl鏈酶卵白素鏈酶卵白素-生物素法生物素法LSABl抗生物素蛋白鏈菌素抗生物素蛋白鏈菌素-生物素復(fù)合物生物素復(fù)合物SABCl酶標(biāo)聚合物法酶標(biāo)聚合物法LDP如如EnVision法法l加強(qiáng)聚合物一步法加強(qiáng)聚合物一步法EPOSl催化信號(hào)放大法催化信號(hào)放大法 CSA石蠟切片標(biāo)本的處置：石蠟切片標(biāo)本的處置： 組織離體后盡快固定，切開(kāi)固定效果好組織離體后盡快固定，切開(kāi)固定效果好，固定液以，固定液以1010福爾馬林緩沖液為佳，固福爾馬林緩

6、沖液為佳，固定時(shí)間在定時(shí)間在4h-24h4h-24h之間，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)影響之間，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)影響抗原決議簇的暴露，產(chǎn)生陰性結(jié)果?？乖瓫Q議簇的暴露，產(chǎn)生陰性結(jié)果。 標(biāo)本的取材厚度以標(biāo)本的取材厚度以2mm2mm為宜，梯度酒精為宜，梯度酒精脫水盡量徹底充分，二甲苯透明時(shí)間不宜脫水盡量徹底充分，二甲苯透明時(shí)間不宜長(zhǎng)，長(zhǎng)，1 13h3h為佳，透明過(guò)度會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬為佳，透明過(guò)度會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆。浸蠟應(yīng)選擇低熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟應(yīng)發(fā)脆。浸蠟應(yīng)選擇低熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟應(yīng)充分。充分。 切片通常以切片通常以3 34um4um的厚度為宜的厚度為宜, ,太厚易掉片太厚易掉片，細(xì)胞重疊，對(duì)細(xì)胞膜陽(yáng)性結(jié)果察看不理想。，細(xì)胞

7、重疊，對(duì)細(xì)胞膜陽(yáng)性結(jié)果察看不理想。裱片要求到達(dá)無(wú)皺折、無(wú)氣泡，水溫宜在裱片要求到達(dá)無(wú)皺折、無(wú)氣泡，水溫宜在48485050，玻片用，玻片用APESAPES或多聚賴氨酸處置，以或多聚賴氨酸處置，以加強(qiáng)粘附性。加強(qiáng)粘附性。80 80 烘烤烘烤1 12h2h。冰凍切片的處置：冰凍切片的處置： 冰凍切片的組織抗原保管好，缺陷是不易做出好冰凍切片的組織抗原保管好，缺陷是不易做出好的冰凍切片，易出現(xiàn)冰晶、細(xì)胞腫脹等景象。通常的冰凍切片，易出現(xiàn)冰晶、細(xì)胞腫脹等景象。通常以以5um5um的厚度為佳，冷風(fēng)吹干后用純丙酮固定的厚度為佳，冷風(fēng)吹干后用純丙酮固定2 2遍遍, ,枯枯燥置入燥置入4 4 冰箱短期保管，冰

8、箱短期保管，2020冰箱長(zhǎng)期枯燥保冰箱長(zhǎng)期枯燥保管。管。 石蠟切片運(yùn)用石蠟切片運(yùn)用3的新穎的新穎H2O2進(jìn)展封鎖，進(jìn)展封鎖， 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫下孵育以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫下孵育10min。 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的封鎖內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的封鎖熱抗原修復(fù)的緩沖液熱抗原修復(fù)的緩沖液 有多種不同的修復(fù)液，如有多種不同的修復(fù)液，如 pH6.0 pH6.0 檸檬酸緩沖液最常用檸檬酸緩沖液最常用、尿素、尿素、Tris-HClTris-HCl、商品化修復(fù)液等。、商品化修復(fù)液等。 堿性堿性 pH pH 修復(fù)液常對(duì)絕大多數(shù)抗體的效果更好。修復(fù)液常對(duì)絕大多數(shù)抗體的效果更好。 引薦運(yùn)用：引薦運(yùn)用：EDTA EDTA 緩沖液緩沖液 pH 8.0 pH 8.0 或或 Tris-EDTA Tris-EDTA 緩沖液緩沖液 pH 9.0 pH 9.0 是較好的常規(guī)修復(fù)液，可用于大多數(shù)熱修復(fù)有效的是較好的常規(guī)修復(fù)液，可用于大多數(shù)熱修復(fù)有效的抗體有選擇性抗體有選擇性, pH6.0, pH6.0緩沖液對(duì)抗體緩沖液對(duì)抗體CD7CD7能夠獲得結(jié)果最能夠獲得結(jié)果最正確。正確。PAP筆畫(huà)圈時(shí)應(yīng)在組織外圍筆畫(huà)圈時(shí)應(yīng)在組織外圍2mm左右，不宜太接近左右，不宜太接近組織。組織。滴加抗體時(shí)應(yīng)從外周