Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系

1、Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系         10-11-15 15:49:00     編輯：studa20                        作者：盧友光 佘林 林李嵩 張聲 丁林燦 【摘要】&

2、#160; 目的 篩選與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的Notch信號(hào)通路基因。 方法 對(duì)已構(gòu)建的涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACCM、ACC2基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在與Notch信號(hào)通路基因進(jìn)行比對(duì)后，篩選出差異基因，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)差異進(jìn)行初步驗(yàn)證。 結(jié)果 涎腺腺樣囊性癌的表達(dá)譜中有46個(gè)基因與Notch信號(hào)通路有關(guān)。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Notch1,Notch2,Notch4，CHUK，F(xiàn)OXC1，F(xiàn)ZD2，F(xiàn)ZD3，GBP2和RUNX1在2個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)Notch1在發(fā)生轉(zhuǎn)移的涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的涎腺腺

3、樣囊性癌（P<0.05）。 結(jié)論 Notch信號(hào)通路中的多個(gè)基因可能參與了涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生和發(fā)展；Notch1的表達(dá)與涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  癌，腺樣囊性； 涎腺腫瘤； 聚合酶鏈反應(yīng)； 細(xì)胞，培養(yǎng)的； 基因表達(dá)； 信號(hào)傳導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌是口腔唾液腺常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，該腫瘤的惡性程度高，術(shù)后易于復(fù)發(fā)，患者預(yù)后較差。目前認(rèn)為多種分子涉及該腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，包括P53、P16、P27、MMPs等。Notch信號(hào)通路是一條古老的信號(hào)通路，相鄰細(xì)胞通過(guò)Notch信號(hào)通路的傳遞，決定細(xì)胞的增殖或凋亡，它參與胚胎發(fā)育，T細(xì)胞的發(fā)育，以及維持造血干細(xì)胞自我

4、更新等。筆者采用第二代差異顯示技術(shù)構(gòu)建了涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的基因表達(dá)譜，通過(guò)生物信息學(xué)分析和半定量RTPCR，發(fā)現(xiàn)Notch基因家族4個(gè)成員在ACC2，ACCM 2個(gè)細(xì)胞株間存在表達(dá)差異1。本研究采用熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證Notch基因家族在這2個(gè)細(xì)胞株中表達(dá)的差異，分析Notch信號(hào)通路42個(gè)主要相關(guān)基因表達(dá)的變化，尋找與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。    1  材料與方法    1.1  材料  人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACCM和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC2由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)

5、院口腔頜面外科腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。其中ACCM為ACC2經(jīng)過(guò)裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)分離出的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。免疫組織化學(xué)標(biāo)本為福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為涎腺腺樣囊性癌的腫瘤石蠟組織標(biāo)本，其中發(fā)生轉(zhuǎn)移者11例，未轉(zhuǎn)移者14例。    1.2  主要試劑和儀器  Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)；Notch1兔多克隆抗體(美國(guó)Neomarker公司)；UltraSensitive SP超敏試劑盒、磷酸鹽緩沖

6、液PBS、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。Mastercycler Gradient 5331 PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；TP800熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)；GeneSnap凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SynGene公司)；石蠟自動(dòng)包埋脫水機(jī)、連續(xù)切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。    1.3  篩選Notch信號(hào)通路相關(guān)基因  根據(jù)文獻(xiàn)2構(gòu)建的涎腺腺樣囊性癌基因表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用圖像分析軟件測(cè)量出所有片段在凝膠上的遷移距離。SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合，找出最佳擬合曲線

7、，計(jì)算各片段bp值。根據(jù)擬合結(jié)果，以片斷大小和所在“表達(dá)窗”作參數(shù)，按2%容許誤差從數(shù)據(jù)庫(kù)(Qbiogene Inc MPBiomedicals Inc公司)確定其所對(duì)應(yīng)的基因，每個(gè)片段數(shù)據(jù)均與NCBI GeneBank直接鏈接，從而對(duì)涎腺腺樣囊性癌的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，初步得出相關(guān)基因。根據(jù)文獻(xiàn)36查找Notch信號(hào)通路上下游相關(guān)基因共113個(gè)，通過(guò)與文獻(xiàn)2構(gòu)建的表達(dá)譜中所得到的5 420個(gè)基因片段的信息進(jìn)行比對(duì)，選出在兩者中共有的基因共46個(gè)，通過(guò)NCBI Genebank和UCSC查詢46種基因的序列，使用Primer 3(v.0.4.0)在線設(shè)計(jì)引物（表1），引物委托上海生工生物工程技

8、術(shù)服務(wù)有限公司合成。    1.4  細(xì)胞株培養(yǎng)  將ACCM、ACC2細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)、取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞通過(guò)Trizol法提取抽提RNA，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度和濃度。通過(guò)分光光度儀測(cè)定260 nm和表1  46種基因及內(nèi)參照引物280 nm的值，兩者比值在1.72.0，并根據(jù)260 nm將各個(gè)樣品總RNA稀釋至相同濃度，使用Prime Script RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。    1.5  熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析  反應(yīng)體系包括

9、：cDNA 2.0 L，上游引物0.5 L，下游引物0.5 L，SYBR Premix Ex Taq 12.5 L，去離子水加至總體積25 L。反應(yīng)條件：94 30 s94 10 s60 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行融解曲線的測(cè)定。以前12個(gè)循環(huán)的熒光值作為熒光本底信號(hào)，第412個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍設(shè)定為閾值，以Actin(ACTB)為管家基因，校正每個(gè)樣品Ct值，數(shù)據(jù)分參照文獻(xiàn)7的方法進(jìn)行。46種基因均采用上述方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時(shí)每個(gè)基因在每個(gè)模板中做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的Ct值取平均值Ct，對(duì)應(yīng)模板內(nèi)參基因（ACTB）Ct值的平均值 Ct(ACTB)：  

10、;  Ct=Ct-Ct(ACTB)；CtCt實(shí)驗(yàn)組-Ct對(duì)照組    對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中待測(cè)基因的倍數(shù)：    N=2-Ct    1.6  免疫組織化學(xué)分析  標(biāo)本取下后立即用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3 m連續(xù)切片。陽(yáng)性對(duì)照采用卵巢癌組織，陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。免疫組織化學(xué)驗(yàn)證采用SP三步法，由2位病理科醫(yī)師盲法閱片，隨機(jī)觀察10個(gè)視野（×400）。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞或陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞<10%為陰性（）；10%50%為陽(yáng)性（+）；&g

11、t;50%為強(qiáng)陽(yáng)性（）。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0軟件包處理。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果采用兩樣本t檢驗(yàn)，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)。=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。    2  結(jié)  果    2.1  PCR分析結(jié)果  對(duì)上述初篩的46種基因進(jìn)行定量RTPCR分析，將對(duì)照組（ACC2）各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量定義為1，ACCM細(xì)胞中這些基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1。與ACC2比較，在46個(gè)基因中，CHUK、FOXC1、FZD2、FZ