DDRT-PCR與反向Northern雜交技術(shù)結(jié)合分離馬鈴薯

1、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11( 5: 545546·研究簡(jiǎn)報(bào)·DDRT-PCR 與反向Northern 雜交技術(shù)結(jié)合分離馬鈴薯mRNA 差異表達(dá)片段*田振東1柳俊2謝從華1*宋波濤1（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢430070；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070）關(guān)鍵詞：DDRT-PCR ；反向Northern 雜交技術(shù)；銀染顯示；馬鈴薯Isolation and Identification of Differentially Expressed mRNA Species

2、 by DDRT-PCRCombined with Reverse Northern Hybridization in PotatoTian Zhendong 1Liu Jun 2Xie Conghua 1*Song Botao 1(1.Collegeof Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China ；2.College of Life Science and Technology ，Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,

3、 ChinaDDRT-PCR ；reverse Northern hybridization ；silver staining display ；potato1mRNA 差異顯示（DDRT-PCR ）技術(shù)因其簡(jiǎn)便、快速Polymerase (5U/ L ，與逆轉(zhuǎn)錄時(shí)對(duì)應(yīng)的錨定引物1.5 L ，1 L 10mer 隨機(jī)引物(10 mol/L，補(bǔ)加無(wú)菌水至終體積為25 L 。PCR 擴(kuò)增條件為:94 2.5min ；94 30s ，40 1min ，72 1.5min ，35個(gè)循環(huán)；72 延伸5min 。1.2.2聚丙烯酰胺膠電泳和銀染顯示差異片段取6 L在6%非變性聚丙PCR 產(chǎn)物加入4 L 2

4、× DNA 上樣緩沖液，烯酰胺膠垂直板（20cm × 30cm ）上用1× TBE 電泳緩沖液電泳，先于250V/10W 預(yù)電泳30min ，然后上樣電泳45h, 直至溴酚藍(lán)離膠底1.5cm 。電泳完畢，取下膠板銀染。去離子水和靈敏度高的特點(diǎn)，已在動(dòng)植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)發(fā)展至今各技術(shù)環(huán)節(jié)已有不少改進(jìn)2,3，但還是存在假陽(yáng)性頻率高，篩選工作繁重的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將差異片段銀染顯示與反向Northern 雜交篩選技術(shù)4結(jié)合，探索適合馬鈴薯mRNA 差異表達(dá)分析的方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料晚疫病病原菌（游動(dòng)孢子誘導(dǎo)DNA中漂2030min 固定液

5、(10%乙醇+0.5%NaAc 中固定3min 染色液(10%乙醇+0.5%NaAc+0.2%AgNO 3 中染色5min 去離子水中漂洗35min 顯色液（3%NaOH+0.5%甲醛）中顯色510min 。1.2.3差異條帶再擴(kuò)增與克隆將僅在處理對(duì)比染色結(jié)果，中出現(xiàn)的差異條帶用干凈小刀小心切下，在去離子水中漂洗加入50 L 無(wú)菌水，二次后放于0.5mL 離心管中，沸水中煮10min ，13000r/min離心10min ，取5 L 上清液作為再擴(kuò)增模板。用與第一次PCR 相同的引物組合和反應(yīng)體系擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段用A-T 克隆法克隆入pUCm-T 載體，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 熏藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化子。

6、1.2.4差異條帶的反向Northern 雜交篩選每個(gè)差異片段隨機(jī)挑取6個(gè)克隆，以1 L 單個(gè)克隆的培養(yǎng)過(guò)夜菌液為模板，T7與M13(R-26引物各1 L （10 mol/L），用與1.2.1相同的PCR 體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 3min ；94 30s ，58 30s ，72 1.5min ，35個(gè)循環(huán)；72 延伸5min 。取5 L PCR 產(chǎn)物與5 L 新鮮配制的0.6mol/LNaOH 混勻，以48h 的溫室生長(zhǎng)的馬鈴薯葉片作為處理材料，未誘導(dǎo)葉片作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)所用錨定引物及隨機(jī)引物polymerase 、dNTPs 和pUCm-T 載體均購(gòu)自上海生工。1.25實(shí)驗(yàn)方法3g 處理與

7、對(duì)照葉片用異硫氰酸胍法1.2.1逆轉(zhuǎn)錄與PCR純抽提總RNA 。取約10 g RNA 先用DNaseI 除去DNA ，化后溶于10 L DEPC 處理的無(wú)菌水中。取4 g 除去DNA 的總RNA 加入2 L 10 mol/L的錨定引物（AAGCT 10C 或AAGCT 10G ），用1 L Superscript ( 逆轉(zhuǎn)錄酶（Life Technique ），以20L 體系按說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)體系為：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 L ，2.5 L 10× PCR Buffer ，2 L MgCl 2(25mmol/L，1 L dNTPs (2mmol/L，0.3 L*基金項(xiàng)目：國(guó)家&qu

8、ot;863" 項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：2002AA241181）。男，田振東：1971年生，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種專業(yè)2000級(jí)在讀博士。*通訊作者。Author for correspondence. E-mail 收稿日期:2002-11-22接受日期:2003-01-03546農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)2003年1滋L 的點(diǎn)樣量對(duì)應(yīng)點(diǎn)2張重復(fù)拷貝膜（Boehringer Mannheim ），點(diǎn)膜完畢將尼龍膜在0.5mol/LTris-HCl(pH恒溫箱中120 烘膜307.5 中和5min ，用雙蒸水漂洗后，min 。兩張重復(fù)拷貝膜分別與DIG 標(biāo)記的處理和對(duì)照cDNA 探針雜交，雜交和顯色

9、依據(jù)Roche 公司DIG High Primer 顯色結(jié)果DNA Labeling and Detection Starter Kit I 說(shuō)明進(jìn)行，用凝膠成像系統(tǒng)在可見(jiàn)光下掃描。對(duì)比2張重復(fù)拷貝膜雜交信號(hào)，選取僅與處理材料探針有雜交信號(hào)的克隆。送專業(yè)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST 軟件進(jìn)行序列分析比較。DDRT-PCR 操作中有兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決：一是如何得到穩(wěn)定、豐富和清晰的差異條帶。二是如何有效地從差異片段中篩選出真正差異表達(dá)的片段。用本實(shí)驗(yàn)的DDRT-PCR 實(shí)驗(yàn)室常體系，采用垂直電泳槽非變性聚丙烯酰胺膠電泳、規(guī)試劑配制的銀染溶液，在馬鈴薯上能夠取得良好差異顯示具體操作效果。由于所

10、用試劑及配制銀染溶液的水質(zhì)差別，中應(yīng)根據(jù)PCR 產(chǎn)物的效率，對(duì)分離上樣量及銀染時(shí)間做適當(dāng)調(diào)整，才能得到清晰帶型。序列膠上顯示的差異條帶，往往混雜大小相同的非差異以此標(biāo)記探針進(jìn)行Northern 雜交，往往表達(dá)的共遷移片段，不能有效鑒定出陽(yáng)性片段，而且1次Northern 雜交只能對(duì)1個(gè)片段篩選。本實(shí)驗(yàn)采用反向Northern 雜交篩選方法4，將差異片段插入載體，挑取一定數(shù)量單克隆，用載體通用引物擴(kuò)有效篩增出插入片段，然后與兩個(gè)探針?lè)謩e進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，選出陽(yáng)性片段。該方法可以同時(shí)對(duì)數(shù)十個(gè)差異片段平行點(diǎn)膜降低工作強(qiáng)度，具有簡(jiǎn)雜交，能夠提高陽(yáng)性片段選擇效率，便、快捷和易于操作的特點(diǎn)。圖3. 與對(duì)照材料

11、制備探針雜交結(jié)果Fig.3. Reverse Northern blot results hybridized with control probeA16,six fragments came from A band; B16,six fragments came from B band.2結(jié)果和分析PCR 產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺膠上垂直電泳分離后銀染，能夠分辨的帶型大約在600bp 以下。圖1顯示用AAGCT 10C 與OPRH-12和AAGCT 10G 與OPRC-40分別對(duì)處理和對(duì)照材料RT-PCR 產(chǎn)物銀染結(jié)果。切下圖1箭頭所示進(jìn)行二次PCR 擴(kuò)增，的兩個(gè)條帶，將產(chǎn)物克隆入pUCm-T

12、 載體。PCR 擴(kuò)增插入片段后點(diǎn)膜，與處理材料標(biāo)記探針?lè)聪颍▓D2）Northern 雜交結(jié)果顯示，A 差異帶所得克隆有2個(gè)顯示出較強(qiáng)雜交信號(hào)，而B(niǎo) 差異帶所得克隆僅有1個(gè)顯示出較強(qiáng)雜交信號(hào)。對(duì)照材料標(biāo)記探針與A 、B 差異帶所得克隆雜交信號(hào)均很弱（圖3），可以視為背景干擾。圖2A 1與B 4克隆測(cè)序與BLAST 檢索結(jié)果表明，A 1為多酚氧化酶基因片段，B 4為晚疫病病原菌菌絲體cDNA 片段。3討論圖1. 處理(T與對(duì)照(CmRNA 差異顯示Fig.1. mRNA differential display of tester （T ）andcontrol （C ）1. PCR amplifi

13、cation with AAGCT 10C and OPRH-12; 2. PCR amplification with AAGCT 10G and OPRC-40. Arrowheads show two differential bands (Aand B.參考文獻(xiàn)1Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of polymerase chain reaction. Science, 1992, 257:9679712Liang P, Pardee A B. Recent a

14、dvances in differential display. Curr Opin Immunol, 1995, 7:2742803Tugores L B, Ledesma J. Differential display of eukaryotic mRNA. Methods Mol Biol, 1999，97:5755904von Stein O D, Thies W G, Hofmann M A. A high through put screening for rarely transcribed differtially expressed genes. Acids Res, 1997, 25:259826025Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation byNucl圖2. 與處理材料制備探針雜