2017南寧科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)推薦書

1、2017年度南寧市科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)推薦書項(xiàng)目基本情況專業(yè)評(píng)審組：輕工化工項(xiàng)目 名稱工業(yè)酶制劑性能改良及其咼效制備 的技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用疋否屬于 ） 保密項(xiàng)目（）A、是BY主要完成單位南寧邦爾克生物技術(shù)有限責(zé)任公司、南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司、廣西科學(xué)院主要完成人韋旭欽、李曉明、韋 航、梁樹華、蒙健宗、李 叢、廖東慶、陸迪、王青艷、林海 鵬、韋函忠、盧運(yùn)琨項(xiàng)目起止時(shí)間2013年1月1日起2016年12月30日止所屬國民 經(jīng)濟(jì)行業(yè)科學(xué)研究、技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目曾獲科技計(jì) 戈9、基金資助情況計(jì)劃、基金名稱編號(hào)下達(dá)部門下達(dá)年度利用整合型重組枯草 芽孢桿菌咼效生產(chǎn)普 魯蘭酶廣西科學(xué)研究 與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃 134

2、8004-2廣西科學(xué)技術(shù)廳2013普魯蘭酶的分子改造 及在枯早芽孢桿菌中 的高效表達(dá)南寧市科技型 中小企業(yè)創(chuàng)新基金 20146371南寧市科學(xué)技術(shù)局2014利用枯草芽孢桿菌整 合系統(tǒng)重組生產(chǎn)多種 工業(yè)酶制劑南寧科技開發(fā)計(jì)劃 20141013南寧市科學(xué)技術(shù)局2014獎(jiǎng)勵(lì)類別（A）A、技術(shù)開發(fā)類B、推廣應(yīng)用類C、重大工程類D、社會(huì)公益類學(xué)科分類名稱（代碼）生物化學(xué)制品（5306250）食品發(fā)酵與釀制技術(shù)（5502040）授權(quán)發(fā)明專利（項(xiàng)）5授權(quán)的其他知識(shí)產(chǎn)權(quán)（項(xiàng)）0南寧市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)委員會(huì)辦公室制、項(xiàng)目簡介一. 科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：輕工化工、生物催化技術(shù)與產(chǎn)品領(lǐng)域二. 簡要背景：生物催化技術(shù)的本質(zhì)是以生

3、物酶制劑為催化劑進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化，大規(guī)模制備人類所需的化學(xué)、醫(yī)藥、食品、能源和新材料等輕化工產(chǎn)品，是解決人類目前面臨的資源、能源及環(huán) 境危機(jī)的有效手段。酶制劑是生物催化的核心關(guān)鍵問題，生物催化工業(yè)首要解決的問題是 獲得大量的性能優(yōu)良的工業(yè)酶制劑。本項(xiàng)目研究在食品、淀粉以及能源等行業(yè)工業(yè)酶制劑關(guān)鍵問題，運(yùn)用先進(jìn)的半理性設(shè) 計(jì)技術(shù)，對(duì)多種工業(yè)酶制劑進(jìn)行性能改良，并利用枯草芽抱桿菌整合表達(dá)系統(tǒng)來高效生產(chǎn) 制備這些工業(yè)酶制劑，突破我國高效制備性能優(yōu)良工業(yè)酶制劑技術(shù)瓶頸，滿足我國輕化工 領(lǐng)域?qū)?yōu)質(zhì)大量普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶、海藻糖合成酶、a乙酰乳酸脫羧酶和禺淀粉酶迫切需求，促進(jìn)我國生物深加工的跨越式發(fā)展。三

4、. 主要技術(shù)內(nèi)容及創(chuàng)新要點(diǎn)1. 主要技術(shù)內(nèi)容(1) 酶分子改造半理性設(shè)計(jì)新策略與技術(shù)；(2) 枯草芽抱桿菌整合表達(dá)新技術(shù)；(3) 染色體同一位點(diǎn)多拷貝基因整合表達(dá)新技術(shù)；(4) 信號(hào)肽分子改良飽和突變技術(shù)；(5) 半理性設(shè)計(jì)對(duì)普魯蘭酶、3-淀粉酶、海藻糖合成酶性能改良和整合高效生產(chǎn)技術(shù)；(6) a乙酰乳酸脫羧酶基因多拷貝整合高效表達(dá)方法。2. 創(chuàng)新要點(diǎn)(1 )開發(fā)和建立工業(yè)酶分子半理性設(shè)計(jì)新策略和技術(shù)；(2) 開發(fā)出枯草芽抱桿菌整合表達(dá)新技術(shù)；(3) 開發(fā)出同一位點(diǎn)多拷貝基因整合表達(dá)新技術(shù)；(4) 開發(fā)出信號(hào)肽N端氨基酸飽和突變技術(shù)；(5) 開發(fā)出新型高效普魯蘭酶(PulB-d99-D436H

5、 )；(6) 開發(fā)出制備麥芽糖淀粉酶芽抱桿菌新菌株；(7) 開發(fā)出海藻糖合成酶新酶融合體；(8) 研發(fā)出a乙酰乳酸脫羧酶等酶的多拷貝整合表達(dá)枯草芽抱桿菌新菌株；(9) 開發(fā)出耐熱、耐酸性新型 禺淀粉酶新突變體。四技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)項(xiàng)目完成-乙酰乳酸脫羧酶、海藻糖合成酶、普魯蘭酶和禺淀粉酶多個(gè)酶制劑的研發(fā)及實(shí)施產(chǎn)業(yè)化,經(jīng)濟(jì)效益明顯，項(xiàng)目2014年以來累計(jì)實(shí)現(xiàn)新產(chǎn)品產(chǎn)值5417.51萬元，銷售6344.39 萬元；實(shí)現(xiàn)利潤767.59萬元，稅收430.37萬元，出口創(chuàng)匯422.5萬美元，節(jié)約能源及原(輔) 材料593.6萬元。其中南寧邦爾克生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)新型一乙酰乳酸脫羧酶達(dá)到 63噸產(chǎn)值18

6、89萬元，生產(chǎn)普魯蘭酶91噸產(chǎn)值907.81萬元；南寧中諾生物工程有限責(zé)任 公司生產(chǎn)食品及高純度海藻糖 296噸產(chǎn)值2306.2萬元。項(xiàng)目申請(qǐng)發(fā)明專利9項(xiàng)，已獲得發(fā) 明專利授權(quán)5項(xiàng)，發(fā)表論文3篇。五.促進(jìn)行業(yè)科技進(jìn)步作用及推廣應(yīng)用、效益情況本項(xiàng)目技術(shù)創(chuàng)新及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，帶來明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，促進(jìn)我國啤酒工 業(yè)和淀粉深加工以及淀粉糖、麥芽糖和麥芽糖醇工業(yè)的發(fā)展，擺脫對(duì)進(jìn)口酶制劑的依賴， 具有重要的戰(zhàn)略意義；研發(fā)的酶制劑廣泛推廣應(yīng)用到淀粉深加工行業(yè)中，進(jìn)一步提高淀粉 的附加值，增加淀粉及其衍生物的品質(zhì)和應(yīng)用范圍，在生產(chǎn)過程中減少環(huán)境污染，具有顯著 的生態(tài)效益。本研究建立一套食品安全的枯草芽

7、抱桿菌整合型高效分泌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)我國 食品加工用酶制劑的安全生產(chǎn)起到了示范作用，對(duì)保證食品加工過程的安全具有示范意 義。項(xiàng)目產(chǎn)品已經(jīng)在全國18家大、中型啤酒制造企業(yè)和 3家淀粉糖制造企業(yè)推廣應(yīng)用， 出口到英國、德國、越南、印度、波蘭、比利時(shí)等6個(gè)國家。本項(xiàng)目2014-2016年，推廣應(yīng)用企業(yè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值17.36億元，新增利潤7528萬元、稅收6038萬元，出口創(chuàng)匯424萬美 元，累計(jì)節(jié)支9912萬元。國內(nèi)相關(guān)行業(yè)受益超過 6.5億元。三、項(xiàng)目主要科技創(chuàng)新闡述項(xiàng)目具有創(chuàng)造性的關(guān)鍵技術(shù)或成果轉(zhuǎn)化和推廣應(yīng)用的集成創(chuàng)新與推廣模式創(chuàng)新內(nèi)容。項(xiàng)目具有創(chuàng)造性的關(guān)鍵技術(shù)：（1）酶分子改造半理性設(shè)計(jì)新策略與新技術(shù)

8、酶的催化反應(yīng)一般經(jīng)過底物結(jié)合（E+S、催化反應(yīng)（ES）以及產(chǎn)物釋放（P+E三個(gè) 過程，通過結(jié)構(gòu)比對(duì)同類酶底物輸送通道（I）、催化反應(yīng)區(qū)域（II、以及產(chǎn)物釋放通道（III、 相關(guān)位點(diǎn)氨基酸的差異（如下圖），準(zhǔn)確、快速地預(yù)測突變的關(guān)鍵位點(diǎn)（即下圖的A、B C D E、F、G的突變位點(diǎn)，即半理性設(shè)計(jì)）。實(shí)驗(yàn)證明，這種半理性設(shè)計(jì)的新策略和技術(shù)能 有效地把酶的有效突變點(diǎn)限制在小范圍內(nèi)（而不是大海撈針），從而有的放矢，能快速、有效地改良酶的特性。本項(xiàng)目獨(dú)創(chuàng)性研發(fā)和運(yùn)用先進(jìn)的半理性設(shè)計(jì)策略與技術(shù)分別對(duì)普魯 蘭酶、麥芽糖淀粉酶、海藻糖合成酶、a乙酰乳酸脫羧酶和 B-淀粉酶分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬（同源建模）和三維結(jié)構(gòu)

9、分析、活性中心和功能位點(diǎn)的預(yù)測和分析等半理性設(shè)計(jì)，再以的 理論模擬結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行有針對(duì)的改良，奠定了工業(yè)酶分子改良的理論基礎(chǔ)，有效地解決了科研實(shí)踐中的盲目性和不可遇見性，大大地節(jié)約時(shí)間和科研資源。該半理性設(shè)計(jì)新策略 與新技術(shù)對(duì)本項(xiàng)目相關(guān)工業(yè)酶的性能改良皆取得可喜成果，不同種類酶優(yōu)良突變體的獲得 詳見下文相關(guān)內(nèi)容。以普魯蘭酶理性設(shè)計(jì)為研究對(duì)象，其理性設(shè)計(jì)策略、方法和技術(shù)成果發(fā)表在核心刊物 上 （長野芽抱桿菌普魯蘭酶的同源建模及其三維結(jié)構(gòu)分析”生物信息學(xué)，2017,15（ 1）:27-32.）。（2）枯草芽抱桿菌整合表達(dá)技術(shù)及基因多拷貝整合高效表達(dá)新技術(shù)枯草芽抱桿菌整合表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前較為先進(jìn)的蛋白

10、表達(dá)系統(tǒng)，本研究通過整合表達(dá)質(zhì) 粒pMLK-8 3,將外源基因連同啟動(dòng)子插入在質(zhì)粒兩段與枯草芽抱桿菌淀粉酶基因同源序列 之間，在同源重組過程中，通過同源雙交換法，這兩段序列與枯草芽抱桿菌淀粉酶基因序 列發(fā)生雙交換，一方面把質(zhì)粒上的兩段同源序列的基因整合到芽抱桿菌染色體上，另一方面使枯草芽抱桿菌淀粉酶基因失活，從而更容易篩選出轉(zhuǎn)化子。通過同源雙交換法將外源 基因整合到芽抱桿菌染色體上，整合的外源基因隨受體染色體DNA勺復(fù)制而復(fù)制，重組菌在沒有抗生素選擇壓力下可以連續(xù)傳代培養(yǎng)而不丟失基因表達(dá)盒，有效地解決了外源基因遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)不穩(wěn)定的問題，同時(shí)解決了基因工程菌在生產(chǎn)過程中濫加抗生素的問題， 明

11、顯減少生產(chǎn)成本，徹底消除抗生素殘留和抗性基因在環(huán)境中的擴(kuò)散，這對(duì)生產(chǎn)食品和藥 品用蛋白質(zhì)產(chǎn)品十分有意義。枯草芽抱桿菌整合表達(dá)系統(tǒng)的研制成功，為高效整合表達(dá)工 業(yè)酶制劑奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。榨命塵HI tttl MorfA.t曰佗e* 3-單個(gè)基因的整合表達(dá)，可以滿足一般酶制劑的生產(chǎn)要求。但對(duì)于表達(dá)量低，表達(dá)基因 的拷貝數(shù)低時(shí)，直接影響外源蛋白的總表達(dá)量。本企業(yè)研發(fā)人員利用豐富的經(jīng)驗(yàn)，獨(dú)創(chuàng)性 開發(fā)多基因整合技術(shù)，即利用整合質(zhì)粒的抗性基因替換的方法結(jié)合篩選標(biāo)記篩選出重組 菌，再用替換抗性基因篩選標(biāo)記的質(zhì)粒替換抗性基因篩選標(biāo)記，經(jīng)過若干輪整合-替換-再整合，可以獲得兩個(gè)或兩個(gè)以上外源基因表達(dá)單元整合到枯草

12、芽抱桿菌染色體基因組同一 位點(diǎn)的重組菌。通過同源重組辦法將編碼工業(yè)酶制劑的基因多個(gè)拷貝整合到芽抱桿菌染色體上，從而 明顯提高酶的合成效率和合成總量。其操作步驟首先是將外源基因表達(dá)單元克隆到含抗性 基因篩選標(biāo)記A的整合質(zhì)粒，利用整合質(zhì)粒將外源基因表達(dá)單元整合到枯草芽抱桿菌染色 體獲得重組菌1,然后利用替換抗性基因篩選標(biāo)記的質(zhì)粒將重組菌1中的抗性基因篩選標(biāo)記A替換為另一抗性基因篩選標(biāo)記 B,得到重組菌2。整合質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化重組菌2,通過抗 性基因篩選標(biāo)記A和B進(jìn)行篩選得到包含兩個(gè)外源基因表達(dá)單元的重組菌。重復(fù)替換抗 性基因和整合，可以獲得兩個(gè)以上相同或不同的外源基因表達(dá)單元整合到枯草芽抱桿菌染 色體的

13、同一位點(diǎn)，有效保證了多個(gè)外源基因的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性?；蚨嗫截愓?表達(dá)技術(shù)研制成功，從根本上解決了單基因表達(dá)拷貝數(shù)低、酶總產(chǎn)量低的問題?？莶菅勘U菌整合表達(dá)技術(shù)及基因多拷貝整合新技術(shù)成果即“一種能用同源重組來克隆的枯草芽抱桿菌整合載體的構(gòu)建及其應(yīng)用”、“將兩個(gè)或兩個(gè)以上外源基因表達(dá)單元 整合到枯草芽抱桿菌染色體同一個(gè)整合位點(diǎn)的方法”都獲得中國專利，并發(fā)表論文1篇即“利用抗性基因替換的方法將兩個(gè)拷貝外源基因表達(dá)單元整合到枯草芽抱桿菌染色體基 因組同一位點(diǎn).基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014 (33) 3, 570 577”。(3) 信號(hào)肽分子改良的飽和突變技術(shù)信號(hào)肽對(duì)于蛋白的分泌表達(dá)起到關(guān)鍵

14、作用，其N端序列影響酶表達(dá)和分泌水平。通過對(duì)枯草芽抱Sec分泌途徑的a乙酰乳酸脫羧酶基因的信號(hào)肽之 N端序列進(jìn)行分析模擬、 飽和突變和篩選，發(fā)現(xiàn)將信號(hào)肽N端序列第7位蘇氨酸替換為纈氨酸時(shí)，酶胞外表達(dá)量明 顯提高，即得到新突變體 WB600p43-bnPul-T7V，該突變體用于表達(dá)重組普魯蘭酶時(shí)，最高發(fā)酵胞外酶活力達(dá)1420 U/ml，分泌率達(dá)88%活力提高達(dá)50%，解決了天然信號(hào)肽分泌 表達(dá)能力較低的問題，該信號(hào)肽突變體可用于多個(gè)工業(yè)酶制劑的表達(dá)生產(chǎn)，其獨(dú)創(chuàng)的技術(shù) 成果已申報(bào)中國專利，即“一種能提高重組普魯蘭酶表達(dá)量的信號(hào)肽突變體及其應(yīng)用，中 國專利，專利申請(qǐng)?zhí)枺篊N201610125646

15、.1,已實(shí)審”。(4) 普魯蘭酶的分子改造及在枯草芽抱桿菌高效表達(dá)新技術(shù)項(xiàng)目構(gòu)建了枯草芽抱桿菌整合型普魯蘭酶表達(dá)系統(tǒng)，新型枯草芽抱桿菌表達(dá)系統(tǒng)成 功、高效表達(dá)了長野芽抱桿菌的普魯蘭酶基因，表達(dá)酶活遠(yuǎn)高于國內(nèi)水平，并進(jìn)行了試生 產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上，項(xiàng)目對(duì)普魯蘭酶進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)和分子改造，獲得了一個(gè)性能優(yōu)異的突 變體PulB-d99-D436H，此突變體更耐酸，在 pH 范圍保持80%勺活力，在pH為3.5時(shí)， 酶活水平由原來的20%提高到60%左右；突變酶在55E 65C的酶活基本不變，而親本酶在 65C時(shí)酶活已經(jīng)降到10%，突變酶在70E的酶活水平由親本酶的小于1%提高到30%左右； 而在37C存

16、放時(shí)，突變酶則顯示出更明顯的優(yōu)勢，存放120天后，仍能保持近90%的活力，而親本酶的活力已經(jīng)降到接近50%，突變酶的這一優(yōu)良穩(wěn)定性，對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸和存放，以 及對(duì)產(chǎn)品酶在應(yīng)用中的持久性都具有非常好的影響。以上結(jié)果表明，突變酶良好的耐酸性和熱穩(wěn)定性，更加適合于淀粉糖化過程較高的溫度(5565E)和微酸性環(huán)境(pH 3.85.5) 這樣的條件，突變酶更適合于工業(yè)化應(yīng)用。經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，40小時(shí)發(fā)酵后，枯草芽抱桿菌整合菌株表達(dá)普魯蘭酶突變體在生 產(chǎn)罐中酶活最高達(dá)1294 U/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國內(nèi)已報(bào)道的發(fā)酵酶活，國外已報(bào)道的最高發(fā)酵 酶活為813 U/mL，但發(fā)酵時(shí)間長達(dá)113小時(shí)；通過對(duì)信號(hào)肽的分子

17、改造，進(jìn)一步提高了普魯蘭酶胞外總表達(dá)活力達(dá)50%以上，小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，胞外酶活由最高的 980 U/mL提高到 1400 U/mL以上，分泌率達(dá)88%普魯蘭酶的生產(chǎn)已商業(yè)化，生產(chǎn)普魯蘭酶 91噸產(chǎn)值907.81 萬元，生產(chǎn)的產(chǎn)品符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。此研究成果申請(qǐng)了4篇專利，已獲授權(quán)1篇，發(fā)達(dá)論文1篇，即“一種高效表達(dá)重組普魯蘭酶的枯草芽抱桿菌及其獲得方法，中國專利，申請(qǐng)?zhí)枺?201310174694.6,已授權(quán)”；“一種普魯蘭酶突變體PulB-d99-D436H的制備方法及其應(yīng)用， 專利申請(qǐng)?zhí)枺篊N201610043739.X，已實(shí)審；“一種外源基因 DNA片段克隆到質(zhì)粒載體相 鄰或重疊的限制性內(nèi)切

18、酶酶切位點(diǎn)的方法，中國專利，申請(qǐng)?zhí)枺?01610219972.9,已實(shí)審”；“一種質(zhì)粒載體的克隆方法及試劑盒，中國專利，申請(qǐng)?zhí)枺?01710030080.9，已實(shí)審”；“長野芽抱桿菌普魯蘭酶的同源建模及其三維結(jié)構(gòu)分析”，生物信息學(xué)，2017，15 (1)：27-32)。(5) 麥芽糖淀粉酶和海藻糖合成酶基因的克隆、改造和表達(dá)研究在國內(nèi)首次克隆來源于嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophiluS)新的麥芽糖淀 粉酶基因，置于不同的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，整合到枯草芽抱桿菌染色體中，構(gòu)建成功生產(chǎn)麥 芽糖淀粉酶新菌株；在國內(nèi)首次克隆研究了來源于谷氨酸棒桿菌(Coryn ebacte

19、riumglutamicum)、彎曲高溫單抱菌 (Thermomonosporacurvata)、水棲嗜熱菌 (Thermus aquaticuS 和玫瑰鏈霉菌的海藻糖合成酶基因，對(duì)這些不同來源的酶進(jìn)行了比較。通過結(jié)構(gòu)分析，對(duì) 來源于玫瑰鏈霉菌的海藻糖合成酶基因進(jìn)行了分子改造，在C端連接上一段能提高其熱穩(wěn) 定的氨基酸序列構(gòu)建得到新的融合酶突變體，海藻糖合成酶融合酶體的最適反應(yīng)溫度從 2025T提高到5055C,熱穩(wěn)定性也得到提高，催化麥芽糖的產(chǎn)物海藻糖得率為79%,比來自嗜熱菌Thermus thermophilus海藻糖合成酶67%的海藻糖得率高，這種海藻糖合成 酶融合酶突變體更有利降低海藻

20、糖的生產(chǎn)成本。此融合體保持了親本酶轉(zhuǎn)換率高的優(yōu)點(diǎn)， 同時(shí)大幅提高了酶的熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度。我們同時(shí)嘗試?yán)迷谑称窇?yīng)用中安全的枯 草芽抱桿菌表達(dá)生產(chǎn)海藻糖合成酶，獲得了整合表達(dá)藻糖合成酶的菌株，而且表達(dá)的海藻 糖合成酶分泌到胞外，無抗菌活性，達(dá)到食品應(yīng)用酶制劑要求，有利于下一步海藻糖的制 造。海藻糖合成酶已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)且用于海藻糖的制備，生產(chǎn)的海藻糖合成酶符合企業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)。此研究申請(qǐng)了 2篇發(fā)明專利，均已獲得授權(quán)，即以整合型重組枯草芽抱桿菌生產(chǎn)海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法.中國專利，申請(qǐng)?zhí)枺?01310174692.7,已授權(quán)”；一種耐 熱海藻糖合成酶融合酶突變體基因及其應(yīng)用，中國專利，申請(qǐng)

21、號(hào)：201310369255.Q授權(quán))”。(6) 新型a乙酰乳酸脫羧酶高活力表達(dá)技術(shù)將a乙酰乳酸脫羧酶基因以多拷貝方式整合到食品安全的宿主枯草芽抱桿菌染色體同 一位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了外源基因在芽抱桿菌染色體多拷貝的表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，從源頭上解決了質(zhì)粒表達(dá)需要在發(fā)酵過程中保持抗生素壓力的問題，不再需要發(fā)酵過程添加抗生素和分離純 化過程中去除抗生素，達(dá)到終產(chǎn)品中無抗菌活性的要求，完全滿足國際市場的質(zhì)量技術(shù)要 求；構(gòu)建的枯草芽抱桿菌整合表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)酶量穩(wěn)定在700-900 U/ml，最高可達(dá)900U/ml;在此基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基，進(jìn)一步提高表達(dá)酶活穩(wěn)定達(dá)到1000-1200 U/ml，最高達(dá)到

22、1300 U/ml以上，分泌率達(dá)95%以上。此研究進(jìn)一步降低了 a乙酰乳酸脫 羧酶的生產(chǎn)成本，提高了綜合競爭力，并且為其他酶制劑的生產(chǎn)提供了發(fā)酵工藝方面的參 考及借鑒，新型a乙酰乳酸脫羧酶繼續(xù)商業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)的產(chǎn)品符合國家標(biāo)準(zhǔn)。其制備方 法“一種以整合型重組枯草芽抱桿菌為菌種生產(chǎn)a-乙酰乳酸脫羧酶的方法”獲得中國專利授權(quán)。(7) 微生物禺淀粉酶分子改造、分泌表達(dá)研究及產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)采用半理性設(shè)計(jì)和計(jì)算軟件 Pre-pKa對(duì)熱硫梭菌3淀粉酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、理性設(shè)計(jì)和 突變篩選，得到了 4個(gè)具有應(yīng)用前景的3-淀粉酶突變體，其中突變體4F12和5C1的最適 反應(yīng)溫度分別為65C和60C，適宜的pH分別為

23、4.57.5和4.56.0;突變體YH2和 PSBA-S4的最適pH為4.0,在pH2.54.5和4575°C條件下穩(wěn)定性好。在分泌表達(dá)方面， 項(xiàng)目以枯草芽抱桿菌為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)整合型高效分泌表達(dá)熱硫梭菌的3淀粉酶，發(fā)酵酶活達(dá)1839 U/mL,分泌率93.5%;項(xiàng)目建成年產(chǎn)100噸新型3淀粉酶的生產(chǎn)線，試產(chǎn)產(chǎn) 品經(jīng)法定機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。其枯草芽抱桿菌整合表達(dá)生產(chǎn)技術(shù) 即“一種在枯草芽抱桿菌中以整合型的方式重組表達(dá)3淀粉酶的方法”取得中國專利，其耐酸性、耐高溫突變體皆取得專利授權(quán)，并發(fā)表論文1篇，即一種耐酸性高溫 3淀粉酶的突變體TBA-H2及其應(yīng)用.中國專利，申

24、請(qǐng)?zhí)枺?01410094145.2已授權(quán)”；一種耐 酸性高溫3淀粉酶突變體及其應(yīng)用.中國專利，申請(qǐng)?zhí)枺?01310730539.8已授權(quán)”； 重 組 Clostridium thermosulfurogenes 3淀粉酶的分泌表達(dá).食品科技，2015 (7)，4044?！蔽濉㈨?xiàng)目曾獲科技獎(jiǎng)勵(lì)情況獲獎(jiǎng)時(shí)間獎(jiǎng)項(xiàng)名稱獎(jiǎng)勵(lì)等級(jí)授獎(jiǎng)部門（單位）無六、公開發(fā)表的論文專著（不超過20篇）序號(hào)論文專著名稱/刊名/作者年卷頁碼 （年卷頁）發(fā)表時(shí)間（年 月）通訊作者第一作者1長野芽孢桿菌普魯蘭酶的同 源建模及其三維結(jié)構(gòu)分析/生 物信息學(xué)/韋旭欽、李曉明、廖東慶、黃日波2017年15卷2732 頁2017年3月韋旭欽韋旭欽2重組 Clostridium thermosulfuroge nes3淀粉酶的分泌表達(dá)/食品科技/梁 鈺等2015年第7期4044 頁2015年6月蒙健宗梁鈺3利用抗性基因替換的方法將 兩個(gè)拷貝外源基因表達(dá)單兀 整合到枯草芽孢