細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)時ppt課件

1、第二章第二章 細(xì)胞生物學(xué)研討方法細(xì)胞生物學(xué)研討方法 Chapter 2 Methods in Cell Biology Research Chapter 2 Methods in Cell Biology Research 細(xì)胞形狀構(gòu)造的察看方法細(xì)胞形狀構(gòu)造的察看方法 Methods for observing cell morphology and structures 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法 Methods for analyzing cell constituents 細(xì)胞培育、細(xì)胞工程細(xì)胞培育、細(xì)胞工程 Cell culture and cell engineering

2、細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化 Dynamic analysis of biological macromolecules in cells 用于細(xì)胞生物學(xué)研討的方式生物用于細(xì)胞生物學(xué)研討的方式生物 Model organisms in cell biology 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞形狀構(gòu)造的察看方法細(xì)胞形狀構(gòu)造的察看方法各類細(xì)胞直徑的比較 顯微鏡顯微鏡電子顯微鏡電子顯微鏡復(fù)式顯微鏡復(fù)式顯微鏡倒置相差顯微鏡倒置相差顯微鏡微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡 光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描電子顯微

3、鏡 研討用顯微鏡研討用顯微鏡單式顯微鏡單式顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡光學(xué)顯微鏡的分辨率光學(xué)顯微鏡的分辨率resolution of optical microscope分辨率分辨率(resolution)區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小間隔小間隔.對任何顯微鏡來說，最重要的性能參數(shù)是分辨率，而不是放大倍數(shù)。對任何顯微鏡來說，最重要的性能參數(shù)是分辨率，而不是放大倍數(shù)。普通光鏡的最大分辨率是普通光鏡的最大分辨率是0.2m。0.2um0.2um0.2nm0.2nm0.1nm0.1nm一、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)1 1、普通光學(xué)顯微

4、鏡、普通光學(xué)顯微鏡 light microscopelight microscope2、相差顯微鏡、相差顯微鏡 phase contrast microscope將透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，提高對比度，構(gòu)造上的特殊之處：將透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，提高對比度，構(gòu)造上的特殊之處：環(huán)形光闌環(huán)形光闌condenser annulus相位板相位板annular phase plate用途：可以察看未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞用途：可以察看未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞F. Zernike于于1935年發(fā)年發(fā)明并因此獲明并因此獲1953年諾年諾貝爾物理獎貝爾物理獎倒置相差顯微鏡倒置相差顯微鏡 in

5、verted phase contrast microscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，可以用于察看培育皿中后者在載物臺之上，可以用于察看培育皿中的活細(xì)胞。的活細(xì)胞。3、微分干涉顯微鏡、微分干涉顯微鏡 differential interference contrast (DIC) microscope在相差顯微鏡原理的根底上，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明在相差顯微鏡原理的根底上，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示構(gòu)造的三維立體投影。與相差顯微鏡相比，立體感更強暗效果，能顯示構(gòu)造的三維立體投影。與

6、相差顯微鏡相比，立體感更強4、熒光顯微鏡、熒光顯微鏡 fluorescence microscope為落射式照明，即光源經(jīng)過物鏡投射于樣品為落射式照明，即光源經(jīng)過物鏡投射于樣品光源為波長較短的光，分辨力強光源為波長較短的光，分辨力強用于察看細(xì)胞組分特異發(fā)出的自然或標(biāo)志熒光用于察看細(xì)胞組分特異發(fā)出的自然或標(biāo)志熒光集多種功能于一體的集多種功能于一體的萬能研討顯微鏡萬能研討顯微鏡兼有明視野、相差、微分干涉、兼有明視野、相差、微分干涉、熒光、顯微攝影等功能，是高級熒光、顯微攝影等功能，是高級研討儀器。研討儀器。5、激光共聚焦掃描顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡 laser confocal scannin

7、g microscope 激光作光源；激光作光源； 經(jīng)過檢測器前小孔成像；經(jīng)過檢測器前小孔成像； 掃描激光聚焦點也是瞬時掃描激光聚焦點也是瞬時成像焦點成像焦點共聚焦。共聚焦。 分辨力為普通光鏡的分辨力為普通光鏡的1.4-1.7倍倍.Epi-fluoresceneConfocal熒光顯微鏡與掃描共焦顯微鏡的比較小鼠腎小球熒光顯微鏡與掃描共焦顯微鏡的比較小鼠腎小球Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin, a green-fluorescent lectin, was used to label elements of the glomeruli and conv

8、oluted tubules. The filamentous actin prevalent in glomeruli and the brush border were stained with red-fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin. The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI. Molecular Probes FluoCells prepared slide #3 (F24630)Zeiss Plan-Neofluor 40 x/1.30

9、OilZeiss C-Apochromat 40 x/1.1 W Corr熒光察看細(xì)胞構(gòu)造熒光察看細(xì)胞構(gòu)造細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化FRETFRP魯斯卡魯斯卡(19061988)，德國物理學(xué)家，德國物理學(xué)家，1932年研制第一臺電子顯微鏡，年研制第一臺電子顯微鏡，1986年年獲諾貝爾物理獎。獲諾貝爾物理獎。二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù) Electron microscopy Electron microscopy 1 1、光鏡與電鏡的主要區(qū)別、光鏡與電鏡的主要區(qū)別1光源不同光源不同: 可見光可見光/紫外線紫外線-電子束電子束 2透鏡不同透鏡不同: 玻璃玻璃-電磁透鏡電磁透鏡 3真

10、空真空 4顯示記錄系統(tǒng)顯示記錄系統(tǒng) 5分辨率分辨率: 0.2 um -0.2 nm1、透射電子顯微鏡、透射電子顯微鏡 transmission electron microscope, TEM透射式電子顯微鏡用于察看小于透射式電子顯微鏡用于察看小于0.2m的細(xì)微構(gòu)造，稱為亞顯微構(gòu)造的細(xì)微構(gòu)造，稱為亞顯微構(gòu)造submicroscopic structures或超微構(gòu)造或超微構(gòu)造ultramicroscopic structures.Figure 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other h

11、eavy metal ions. 超薄切片制樣技術(shù)超薄切片制樣技術(shù)取材取材固定固定脫水脫水浸透、包埋浸透、包埋超薄切片超薄切片 厚度厚度40-50nm染色染色電鏡的實踐分辨率與切片厚電鏡的實踐分辨率與切片厚度有關(guān)度有關(guān)負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色技術(shù) Negative staining 負(fù)染色是用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進負(fù)染色是用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進展染色，吸去多余染料，樣品經(jīng)自然枯燥后，展染色，吸去多余染料，樣品經(jīng)自然枯燥后，整個載網(wǎng)上都鋪上了一薄層重金屬鹽，從而烘整個載網(wǎng)上都鋪上了一薄層重金屬鹽，從而烘托出樣品的精細(xì)構(gòu)造。托出樣品的精細(xì)構(gòu)造。 Figure 3-29. Electron

12、 micrograph of negatively stained actin filaments. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) 亦稱冰凍斷裂，主要用來察看膜斷裂面的蛋白亦稱冰凍斷裂，主要用來察看膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜外表構(gòu)造。質(zhì)顆粒和膜外表構(gòu)造。冷凍蝕刻電鏡技術(shù)冷凍蝕刻電鏡技術(shù) Freeze E

13、tching electron microscopy2、掃描電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡 scanning electron microscope, SEM20世紀(jì)世紀(jì)60年代問世，用來察看標(biāo)本的外表構(gòu)造年代問世，用來察看標(biāo)本的外表構(gòu)造目前掃描電鏡的分辨力為目前掃描電鏡的分辨力為 610 nm。Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A)

14、. For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).三、掃描隧道顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡 scanning tunneling microscope, STMBinnig和和Rohere 1981年發(fā)明，年發(fā)明，1986年獲獎；年獲獎；可察看到原子級的圖像?？刹炜吹皆蛹壍膱D像。X-ray crystallography X射線衍射射線衍射B. NMR

15、 spectroscopy核磁共振成像核磁共振成像第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法一、用離心技術(shù)分別細(xì)胞器與生物大分子一、用離心技術(shù)分別細(xì)胞器與生物大分子普通離心機：轉(zhuǎn)速普通離心機：轉(zhuǎn)速25000 r/min超速離心機：超速離心機：30000 r/min在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分別不同大小的細(xì)胞和在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分別不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器細(xì)胞器 。1 1、差速離心、差速離心 differential centrifugationdifferential centrifugation細(xì)胞器沉降順序：核、線粒體、溶酶體與過細(xì)胞器沉降

16、順序：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體。氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體。2 2、密度梯度離心、密度梯度離心 density gradient centrifugation density gradient centrifugation 用介質(zhì)在離心管內(nèi)構(gòu)成延續(xù)或不延續(xù)的密度梯度，細(xì)胞混懸液或勻漿置于用介質(zhì)在離心管內(nèi)構(gòu)成延續(xù)或不延續(xù)的密度梯度，細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)頂部，經(jīng)過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分別。介質(zhì)頂部，經(jīng)過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分別。常用介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖常用介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖分為速度沉降分為速度沉降velocity sedimentation

17、和等密度沉降和等密度沉降equilibrium sedimentation 。其它生化分別方法其它生化分別方法紙色譜柱色譜親和色譜Figure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).Figure 3-44. Separation of protein molecules by isoelectric focusing.Figure 3-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖等成分的顯示方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖等成分的顯

18、示方法為了對某些細(xì)胞成分進展定性和定位研討，利用染色劑可與細(xì)胞某種成分為了對某些細(xì)胞成分進展定性和定位研討，利用染色劑可與細(xì)胞某種成分發(fā)生反響而著色的原理加以顯示，稱為組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法發(fā)生反響而著色的原理加以顯示，稱為組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法histochemical and cytochemical staining method；如：細(xì)胞內(nèi)如：細(xì)胞內(nèi)DNA和和RNA的原位顯示的原位顯示 Myofibrillar ATPase: Identifying Fast and Slow FibersSuccinate Dehydrogenase(琥珀脫氫酶): Identifying

19、Oxidati ve Potential Promoter:GUS是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專注結(jié)合，對抗原進展定位測定的是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專注結(jié)合，對抗原進展定位測定的技術(shù)，常用的標(biāo)志物有熒光素和酶技術(shù)，常用的標(biāo)志物有熒光素和酶免疫熒光法免疫熒光法immunofluorescent technique酶標(biāo)免疫法酶標(biāo)免疫法enzyme-labeled antibody method免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué) immuno-cytochemistry二、細(xì)胞內(nèi)特異蛋白質(zhì)的定位和定性免疫熒光法免疫熒光法酶標(biāo)免疫法酶標(biāo)免疫法 利用分子探針檢測細(xì)胞內(nèi)特殊利用分子探針檢測細(xì)胞內(nèi)

20、特殊DNA序列、和序列、和RNA基因表達(dá)的方法。基因表達(dá)的方法。四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位和定性原位雜交in situ hybridization人類染色體端粒人類染色體端粒DNADNA的熒光原位雜的熒光原位雜交照片交照片果蠅果蠅HBHB基因表達(dá)的原位雜交照基因表達(dá)的原位雜交照片片五、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)對單個細(xì)胞進展快速定量分對單個細(xì)胞進展快速定量分析分選的一門技術(shù)；析分選的一門技術(shù)；流式細(xì)胞術(shù) flow cytometry第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞培育、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞培育、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)活體或在體活體或在體(in vivo ) (in vivo ) 離體或體外離體或體外(in

21、 vitro ) (in vitro ) 細(xì)胞培育細(xì)胞培育 (cell culture) (cell culture) 就是選用最正確生存條件對活細(xì)胞進展培育和就是選用最正確生存條件對活細(xì)胞進展培育和研討的技術(shù)；研討的技術(shù)；原代培育原代培育 (primary culture)：從動物機體取出進展培育的細(xì)胞群。：從動物機體取出進展培育的細(xì)胞群。傳代培育傳代培育 (passage)：將細(xì)胞從一個培育瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培育瓶即稱：將細(xì)胞從一個培育瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培育瓶即稱為傳代或傳代培育。為傳代或傳代培育。細(xì)胞株細(xì)胞株 (cell strain) 和細(xì)胞系和細(xì)胞系(cell line)一、動物細(xì)胞培育

22、一、動物細(xì)胞培育cell culture二、植物細(xì)胞培育二、植物細(xì)胞培育組織培育組織培育 (tissue culture)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)再分化可培育出再生：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)再分化可培育出再生植株植株 單倍體培育單倍體培育(haploid culture )：花藥或花粉培育獲得單倍體植株，人為加：花藥或花粉培育獲得單倍體植株，人為加倍后可得到完全純合的個體倍后可得到完全純合的個體原生質(zhì)體培育原生質(zhì)體培育(protoplast culture)：兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞交融兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞交融 (cell fusion

23、)或細(xì)胞雜交或細(xì)胞雜交 (cell hybridization)基因型一樣的細(xì)胞交融稱為同核體；來自不同基因型的雜交細(xì)胞稱為異核基因型一樣的細(xì)胞交融稱為同核體；來自不同基因型的雜交細(xì)胞稱為異核體；體；誘導(dǎo)方法：生物誘導(dǎo)方法：生物(病毒病毒)、化學(xué)、化學(xué)(PEG)、物理、物理(電激、激光電激、激光)。三、細(xì)胞工程三、細(xì)胞工程 細(xì)胞交融細(xì)胞交融單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù) monoclonal antibody technique英國人英國人Kohler和和Milstein 1975年年將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)建了單克隆抗將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)建了單克隆抗體技術(shù)，獲體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎年諾貝爾獎顯微

24、操作技術(shù)顯微操作技術(shù) micromanipulation technique第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化一、熒光漂白恢復(fù)一、熒光漂白恢復(fù)fluorescence photobleaching recovery, FRP技術(shù)技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)photobleaching, FRAP)二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)fluorescence resonance energy transferfluorescence resonance energy transfer三、單分子技術(shù)三、