見血封喉內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究

1、第40卷第6期2009年6月中草藥ChineseTraditionalandHerbalDrugs植物學(xué)報(bào),1997,17(1):4925519李昂,葛頌1植物保護(hù)遺傳學(xué)研究進(jìn)展J1生物多樣性,2002,10(1):61271110肖猛1瀕危植物桃兒七的遺傳多樣性研究D1成都:四川大學(xué),2006195511馬紹賓,胡志浩1桃兒七分布格局與生態(tài)適應(yīng)的初步研究J1武漢植物學(xué)研究,1996,14(1):47254112田英,郭帥,彭勵(lì),等1寧夏六盤山瀕危植物桃兒七的生存現(xiàn)狀及保護(hù)對(duì)策研究J1農(nóng)業(yè)科學(xué)研究,2006,27(2):822851見血封喉內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究戴文君1,張秀環(huán)1,黃

2、貴修2,戴好富1,梅文莉1環(huán)境與植物保護(hù)研究所,海南儋州571737)摘要:目的分離和鑒定見血封喉Antiaristoxicaria。方法以金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、耐甲氧西林金黃色球2taphylococcusaureus(MRSA)和白色念珠菌Candidaalbicans作為指示菌,。結(jié)果從見血封喉根的韌皮部中分離出6株內(nèi)生真菌,(TrichotheciumLK1exFr1)、枝頂孢霉屬(AcremoniumLK1exFr1)(RFr1)。其中內(nèi)生真菌J6的發(fā)酵上清液對(duì)MR2SA有抑菌活性,抑菌圈直徑為,內(nèi)生真菌J6對(duì)MRSA有明顯的抑菌活性,。關(guān)鍵詞:中圖

3、分類號(hào)文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):025322670(2009)06209552033(11中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,海南?？?71101;21中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院Isolation,identification,andantimicrobialactivityofendophyticfungifromAntiaristoxicariaDAIWen2jun1,ZHANGXiu2huan1,HUANGGui2xiu2,DAIHao2fu1,MEIWen2li1(11InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofT

4、ropicalAgriculturalSciences,Haikou571101,China;21EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou571737,China)Abstract:ObjectiveToisolateandidentifyendophyticfungifromthephloemintherootofAntiaristoxicariaanddetecttheantimicrobialactivityofthesestrains1Metho

5、dsStaphylococcusaureus,methicil2lin2resistantStaphylococcusaureus(MRSA),andCandidaalbicanswereselectedasindicators1Theanti2microbialactivitiesofthefermentationfiltrateofendophyticfungiweretestedbycylinderplatemethod1ResultsSixendophyticfungiwereisolatedfromthephloemintherootofA1toxicaria.Thesestrain

6、sweremorphologicallyidentifiedtogenusofTrichotheciumLK.exFr.,AcremoniumLK1exFr1andRhi2zoctoniaDC1exFr1ThefermentationfiltrateofendophyticfungusJ6showedtheantimicrobialactivitya2gainstMRSA1Thediameterofinhibitionzonewas18mm1ConclusionItsthefirstreportabouttheen2dophyticfungifromA1toxicaria1Endophytic

7、fungusJ6exhibitsstrongantimicrobialactivityagainstMR2SA,itsactivecomponentsareofworthtofurtherstudy1Keywords:Antiaristoxicaria(Pers1)Lesch1;endophyticfungi;antimicrobialactivity植物內(nèi)生真菌是指生長(zhǎng)于植物的根、莖、葉等組織和器官內(nèi)的一類真菌,是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分,在進(jìn)化過(guò)程中與植物宿主建立了和諧的共生關(guān)系,其次生代謝產(chǎn)物十分豐富,是新化合3收稿日期:2008209218基金項(xiàng)目:973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)(200

8、7CB116306);海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30608);海南省自然科學(xué)基金指導(dǎo)性項(xiàng)目(80671),女,湖北武漢人,碩士研究生,現(xiàn)主要從事微生物學(xué)研究。作者簡(jiǎn)介:戴文君(1984Tel:(0898)66968572E2mail:daishu198420033通訊作者梅文莉Tel:(0898)66988061E2mail:meiwenliyahoo1com1cn956第40卷第6期2009年6月中草藥ChineseTraditionalandHerbalDrugs物、新藥源的潛在資源1。Strobel等2認(rèn)為,那些生長(zhǎng)于獨(dú)特生態(tài)環(huán)境的植物、有著民族藥用歷史的植物、樹齡較長(zhǎng)或者當(dāng)?shù)靥赜械闹?/p>

9、物往往具有特殊的內(nèi)生真菌,這些內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物往往很特別,可用于新藥開發(fā)。近年來(lái),我國(guó)藥用植物內(nèi)生真菌及其活性成分的研究成為了藥物開發(fā)的熱點(diǎn)3,4。見血封喉Antiaristoxicaria(Pers1)Le2sch1為?？埔娧夂韺僦参?別名箭毒木、剪刀樹、股份有限公司);ZD8802D搖床(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);HHB11360S普通培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。2方法211內(nèi)生真菌的分離與純化7:將剛采集的新鮮見血封喉的板狀根韌皮部用自來(lái)水洗凈泥土及灰塵,瀝干水分。再將材料放進(jìn)經(jīng)過(guò)紫外線消毒的超凈工作臺(tái)內(nèi),切割成110cm×210cm小段,按常規(guī)無(wú)菌操作進(jìn)行表面

10、消費(fèi)處理:75%乙醇浸泡3min無(wú)菌水沖洗3遍011%升汞浸泡8min無(wú)菌水沖洗3遍。,在無(wú)0的小塊,放置于新鮮,每個(gè)平板放置4塊,28恒7d。待切口邊緣長(zhǎng)出真菌菌絲,及時(shí)轉(zhuǎn)PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),采用菌絲頂端純化法逐步純化。同時(shí),以消毒后不做切割的材料作為空白對(duì)照,同樣條件下觀察是否有菌長(zhǎng)出,結(jié)果對(duì)照材料周圍無(wú)任何菌長(zhǎng)出,證明表面消費(fèi)徹底。212內(nèi)生真菌的鑒定:采用真菌學(xué)插片培養(yǎng)方法,對(duì)分離獲得的見血封喉內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征(菌絲、孢子形態(tài)等)的觀察、分類鑒定。分類檢索參照文獻(xiàn)報(bào)道8。213內(nèi)生真菌的發(fā)酵上清液制備:將分離得到的菌株,切取黃豆粒大小的菌絲塊,接種于PDB培養(yǎng)基中。1L三角瓶裝

11、400mL培養(yǎng)液,室溫,164r/min振蕩培養(yǎng)7d,同時(shí)以純培養(yǎng)基作空白對(duì)照。無(wú)菌條件下取發(fā)酵液15mL于離心管中,12000r/min離心30min后取上清液,用012m微孔濾膜濾過(guò)除菌,-20保存?zhèn)溆谩?14抑菌活性測(cè)定:采用杯碟法測(cè)定樣品抑菌活性。金黃色葡萄球菌和MRSA采用NA培養(yǎng)基,白色念珠菌采用YPD培養(yǎng)基。將金黃色葡萄球菌、MRSA和白色念珠菌分別制成一定濃度的菌懸液(1×1051×107cfu/mL),用棉簽將其均勻涂布在供試無(wú)菌培養(yǎng)皿中,制成含菌平板,然后在每個(gè)平板放入3個(gè)牛津杯,分別取樣品200L加入其內(nèi),同時(shí)以發(fā)酵純培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。金黃色葡萄球菌和

12、MRSA在37下恒溫培養(yǎng),白色念珠菌在28下恒溫培養(yǎng)。24h后觀察結(jié)果,測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù),以抑菌圈直徑的平均值為試驗(yàn)結(jié)果。3結(jié)果與分析311內(nèi)生真菌的分離結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)共分離獲得6株加布,在我國(guó)已被列為三級(jí)瀕危珍稀植物。見血封喉屬植物有4個(gè)種3個(gè)變種,主要分布于東南亞。我國(guó)僅產(chǎn)1種,即見血封喉,分布于海南、廣東、廣西等地。其鮮樹汁乳白色,有劇毒,入藥用于催吐、泄瀉、強(qiáng)心,還可用作麻醉劑;種子也有毒,入藥解熱止瀉,用于治療痢疾5,6。目前,對(duì)見血封喉內(nèi)生真菌的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。1材料111供試材料:部分的板狀根韌皮部。植物材料于2007年3月采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶植

13、物園,由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定,植物標(biāo)本和菌株保存在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。112培養(yǎng)基:PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,定容至1L,pH值自然,121滅菌20min,第一次分離時(shí)在培養(yǎng)基中加鏈霉素(50U/mL)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,定容至1L,pH值自然,121滅菌20min。NA培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂):牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,定容至1L,pH714716,121滅菌30min;YPD培養(yǎng)基(酵母粉胨葡萄糖瓊脂):葡萄糖20

14、g,胰蛋白胨20g,酵母粉10g,定容至1L,pH710,121滅菌30min。113指示菌:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methi2cillin2resistantStaphylococcusaureus,MRSA)ATCC9551由英國(guó)HeriotWatt大學(xué)GrantJBur2gess博士提供;金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC51650和白色念珠菌Candidaalbi2cansATCC10231均購(gòu)于海南省藥品檢驗(yàn)所。114儀器:SW40潔凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HVE50滅菌鍋(今日儀器第40卷第6期2009年6月中草藥ChineseT

15、raditionalandHerbalDrugs957內(nèi)生真菌(J1J6),經(jīng)顯微形態(tài)觀察,初步鑒定分別為聚端孢霉屬、枝頂孢霉屬和絲核菌屬(表1),其顯微形態(tài)特征見圖1。表1見血封喉根韌皮部?jī)?nèi)生真菌的種群組成Table1DistributionofendophyticfungiisolatedfromphloeminrootofA1toxicaria綱目科屬菌株數(shù)目321編號(hào)J3,J4,J6J1,J2J5半知菌類從梗孢目從梗孢科聚端孢霉屬枝頂孢霉屬無(wú)孢菌群絲核菌屬圖1nhibitionofJ6onMRSA,。由于本試驗(yàn)主要針對(duì)絲狀真菌,則未對(duì)其進(jìn)行分離。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明內(nèi)生真菌J6的發(fā)酵上

16、清液對(duì)MRSA有明顯的抑制作用。J6為聚端孢霉屬真菌,有報(bào)道10顯示該屬中有的種作為菌寄生真菌,能有效地抑制病原菌的擴(kuò)展和危害,甚至殺死病原菌。目前,本課題組正在對(duì)內(nèi)生真菌J6的抑菌活性成分進(jìn)行研究。致謝:本研究在內(nèi)生真菌的分類鑒定方面得到了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所邢曉科副研究員的大力支持和幫助!參考文獻(xiàn):圖1見血封喉內(nèi)生真菌顯微形態(tài)特征Fig11MicroscopicalmorphologicalcharactersofendophyticfungifromA1toxicaria1鄒文欣,譚仁祥1植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展J1植物學(xué)報(bào),2001,43(9):881289212StrobelG,

17、DaisyB1BioprospectingformicrobialendophytesandtheirnaturalproductsJ1MicrobiolMolBiolRev,2003,67:491250213秦盛,邢珂,吳少華,等13種仙人掌植物內(nèi)生真菌抑456789312內(nèi)生真菌的抑菌活性:采用杯碟法對(duì)所分離到的見血封喉內(nèi)生真菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行了3種人體病原菌的抑菌活性試驗(yàn),結(jié)果表明內(nèi)生真菌J6的發(fā)酵上清液對(duì)MRSA有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑為18mm(圖2)。4討論本實(shí)驗(yàn)首次從見血封喉的板狀根韌皮部中分離獲得6株內(nèi)生真菌,經(jīng)初步鑒定,分別為聚端孢霉屬、枝頂孢霉屬和絲核菌屬,此次分離獲得的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量均較少。已有報(bào)道指出內(nèi)生真菌之間存在占位效應(yīng),一種優(yōu)勢(shì)種進(jìn)入植物內(nèi)部,建立共生關(guān)系,往往影響其他菌的進(jìn)入9。本實(shí)驗(yàn)在分離見血封喉內(nèi)生真菌時(shí),曾發(fā)現(xiàn)消毒完全的組織塊周圍有大量的酵母菌長(zhǎng)出,由此推測(cè),酵母菌大量存在于10菌活性的研究J1中草藥,2006,37(6):91729211曾松榮,徐倩雯,葉保童,等1虎杖內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的篩選J1菌物研究,2005,3(2):24