園藝基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)Ⅱ園藝

1、園藝基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程教案（12園藝，2013.9.11胡志輝）課程編號：1202118課程英文名稱：horticultural base experiment 學(xué)時學(xué)分：48學(xué)時1.5學(xué)分開課學(xué)期（春、秋、全年）：全年先修課程：植物生理學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)適用專業(yè)：園藝專業(yè)（本科）一、課程簡介園藝基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)是園藝專業(yè)學(xué)生必修的一門專業(yè)基礎(chǔ)課程，是一門獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)課程，同時也是為了配合植物生理生化和遺傳學(xué)的教學(xué)而開設(shè)的一門實(shí)驗(yàn)課程,本課程由驗(yàn)證性、操作性、綜合性和設(shè)計性等多層次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容構(gòu)成。課程主要內(nèi)容包括：植物組織水勢的測定，不良環(huán)境對植物生理生化的影響，植物呼吸速率的測定，抗壞血酸含量的測定，植物種

2、子蛋白質(zhì)組分的分析，高等植物DNA的提純與檢測，植物多倍體的誘導(dǎo)與鑒定，植物染色體組型分析。通過本課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，使學(xué)生掌握植物細(xì)胞遺傳學(xué)和植物生理生化研究的基本方法、基本技能，培養(yǎng)其獨(dú)立工作和創(chuàng)新能力，為今后學(xué)習(xí)和工作打下良好的基礎(chǔ)。二、教學(xué)目的本課程由驗(yàn)證性、操作性、綜合性和設(shè)計性等多層次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容構(gòu)成，目的在于鞏固和加深學(xué)生對植物生理生化和遺傳學(xué)知識的理解，驗(yàn)證植物生理生化和遺傳學(xué)理論，并初步掌握植物生理生化和遺傳學(xué)研究所必需的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行一定比例的綜合性、設(shè)計性實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)理論和實(shí)驗(yàn)技能融為一體，從而培養(yǎng)學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)思想、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)技能和綜合應(yīng)用能力。本課程的任務(wù)

3、是從個體、細(xì)胞、分子三個水平揭示植物生理生化和遺傳學(xué)的基本現(xiàn)象與規(guī)律，培養(yǎng)學(xué)生牢固掌握植物生理生化和經(jīng)典遺傳學(xué)研究方法與技術(shù)，并初步掌握現(xiàn)代植物生理生化和遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)分析方法，同時要求學(xué)生初步具備進(jìn)行植物生理生化和遺傳學(xué)創(chuàng)新性研究的基本能力與素質(zhì)。三、教學(xué)要求本課程應(yīng)在植物學(xué)實(shí)驗(yàn)、無機(jī)及分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)、有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)等課程之后開設(shè)的課程。本實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容包括驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)、操作性實(shí)驗(yàn)、綜合性實(shí)驗(yàn)、自行設(shè)計性實(shí)驗(yàn)四個部分，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)主要通過演示方法進(jìn)行教學(xué)，操作性和綜合性實(shí)驗(yàn)在教師指導(dǎo)下由學(xué)生自己動手完成，同時要求學(xué)生根據(jù)所掌握的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)技能，設(shè)計性實(shí)驗(yàn)經(jīng)教師認(rèn)可后獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)操作，并撰寫書面報告。 1

4、、注意理論與實(shí)踐結(jié)合，增加聯(lián)系生產(chǎn)實(shí)際的內(nèi)容。 2、關(guān)注植物生命科學(xué)的發(fā)展前沿，將植物生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)先進(jìn)手段納入教學(xué)內(nèi)容。 3、通過對學(xué)生植物生理生化及遺傳等生命活動的基本實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練，加強(qiáng)對學(xué)生動手能力的培養(yǎng)，同時力求理論聯(lián)系實(shí)際地培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、綜合分析能力、科學(xué)思維能力、創(chuàng)新意識，全面提高學(xué)生素質(zhì)。四、教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)：植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定，植物多倍體的誘導(dǎo)與鑒定。教學(xué)難點(diǎn)：植物種子蛋白質(zhì)組分的分析和植物染色體組型分析。五、教學(xué)內(nèi)容（含教學(xué)時間分配表）： 教 學(xué) 時 間 分 配 表章節(jié) 內(nèi) 容學(xué)時備注1實(shí)驗(yàn)1.小液流法測定植物組織水勢4操作性實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)2. 不良環(huán)境對

5、植物生理生化的影響8設(shè)計性實(shí)驗(yàn)3實(shí)驗(yàn)3. 植物呼吸速率的測定4操作性實(shí)驗(yàn)4實(shí)驗(yàn)4. 抗壞血酸含量的測定4操作性實(shí)驗(yàn)5實(shí)驗(yàn)5. 植物種子蛋白質(zhì)組分的分析 16綜合性實(shí)驗(yàn)6實(shí)驗(yàn)6. 植物多倍體的誘導(dǎo)與鑒定8綜合性實(shí)驗(yàn)7實(shí)驗(yàn)7.植物染色體組型分析4驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)總學(xué)時48教學(xué) 48學(xué)時 輔導(dǎo) 學(xué)時 機(jī)動 學(xué)時共48學(xué)時六、考核內(nèi)容及辦法1.平時成績：包括考勤、作業(yè)、課堂提問等，占綜合考核成績10% 2.實(shí)驗(yàn)成績：包括實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)報告和自行設(shè)計實(shí)驗(yàn)，占綜合考核成績30%3.考試成績：期末閉卷筆試，占綜合考核成績60%4.綜合考核成績：100%七、教材與主要參考書 （一）、教材 生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程，江漢

6、大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心編，江漢大學(xué)教材科印 （二）、參考書 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)，李合生主編，高等教育出版社遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教程，王建波等編，武漢大學(xué)出版社實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)報告要求一、 實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)前應(yīng)認(rèn)真預(yù)習(xí)，把實(shí)驗(yàn)名稱、目的要求、原理、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、操作方法以及實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)的記錄表格簡要地列于記錄本中。實(shí)驗(yàn)記錄本應(yīng)標(biāo)上頁數(shù)，不能隨意撕去任何一頁，不要擦抹及修改。寫錯時可準(zhǔn)確地劃去重寫。實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象、數(shù)據(jù)，應(yīng)及時并正確地記錄于記錄本上，切忌夾雜任何主觀因素。定量的數(shù)據(jù)，如稱量物的重量、滴定管讀數(shù)和分光光度計讀數(shù)等，應(yīng)根據(jù)儀器的精確度準(zhǔn)確記錄有效數(shù)字。每一結(jié)果最少要重復(fù)觀測兩次，重復(fù)觀測數(shù)據(jù)即使完

7、全相同也應(yīng)如實(shí)記錄下來，因?yàn)槊總€數(shù)據(jù)都是一次觀測的結(jié)果。數(shù)據(jù)的計算也應(yīng)寫在記錄本上?？傊瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果的原始積累記錄應(yīng)做到準(zhǔn)確、清楚、詳盡、簡練。實(shí)驗(yàn)中使用的儀器型號和試劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、準(zhǔn)確濃度都應(yīng)記錄清楚，以便總結(jié)實(shí)驗(yàn)時核對和作為查找失敗原因的參考依據(jù)。如果認(rèn)為記錄的結(jié)果可疑或發(fā)現(xiàn)記錄遺漏和丟失，應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)，決不能把不可靠的結(jié)果當(dāng)作正確記錄，造成實(shí)際工作中難以估計的損失。二 、實(shí)驗(yàn)報告實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報告，一般實(shí)驗(yàn)報告內(nèi)容包括：（1） 實(shí)驗(yàn)名稱（題目）（2） 原理（3） 試劑和儀器（4） 操作方法（5） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（6） 分析討論（7） 參考文獻(xiàn)一份實(shí)驗(yàn)報

8、告就相當(dāng)于一篇小論文。在報告中，應(yīng)寫清楚實(shí)驗(yàn)名稱，做實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)設(shè)計的基本原理：操作方法可采用工藝流程圖的方式或自行設(shè)計表格來扼要明了表示；試劑名稱、純度和配制要求以及儀器和儀器裝置圖應(yīng)寫清楚或附上；結(jié)果應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件下觀察到的現(xiàn)象和獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納、整理，總結(jié)成各種圖表，同時針對圖表的結(jié)果進(jìn)行必要的說明和分析；分析討論可包括對實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的探討及疑難問題的分析，對實(shí)驗(yàn)設(shè)計的認(rèn)識、體會和建議，以及對實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)意見等。當(dāng)然，不同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報告的側(cè)重點(diǎn)應(yīng)有所不同。制備實(shí)驗(yàn)應(yīng)重點(diǎn)集中于制備方法、裝置的設(shè)計和討論；定量實(shí)驗(yàn)較著重與對結(jié)果和數(shù)據(jù)的總結(jié)和分析；定性實(shí)驗(yàn)往往內(nèi)容較多，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)

9、容分別寫原理、方法、結(jié)果和討論。實(shí)驗(yàn)報告并非要求定式，但應(yīng)該讓人們清楚了解實(shí)驗(yàn)的設(shè)計、目的和意義。希望學(xué)生們課前做好預(yù)習(xí)工作，課上多動腦筋、動手，課后寫好實(shí)驗(yàn)報告，你們本學(xué)期的實(shí)驗(yàn)成績是預(yù)習(xí)情況、平時課堂表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)報告的綜合評分。真誠地希望通過一個學(xué)期實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)與訓(xùn)練，能夠提高大家的而是眼操作技能，并培養(yǎng)你們嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)、積極進(jìn)取的科學(xué)態(tài)度及優(yōu)秀品格。實(shí)驗(yàn)1 小液流法測定植物組織水勢（操作性實(shí)驗(yàn)，4學(xué)時）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?測定植物組織水勢的方法教多，小液流法是其中一種。本法是將植物組織置于不同濃度（也即不同水勢）的蔗糖溶液中，尋找到一種濃度的蔗糖溶，其水勢與植物組織的水勢相等，然后計算該濃度蔗糖溶液

10、的水勢，從而知道植物組織的水勢。植物組織和外界溶液組成的體系處在恒溫恒壓下，整個體系的水勢由植物組織的水勢和溶液的滲透勢組成，它們之間的水勢差為： sw （） s是溶液的滲透勢，w是植物組織的水勢（water potential）。如果兩部分達(dá)到平衡，則 ws （）即植物組織的水勢等于溶液的滲透勢。溶液的滲透勢依據(jù)范特荷夫公式計算： siCRT（MPa） （）其中是范特荷夫系數(shù)或等滲系數(shù)、解離常數(shù)（蔗糖=1，CaCl2=2.60），是溶液的摩爾濃度（mol/Kg），是理想氣體常數(shù)（即0.008314LMPa/（molK），是絕對溫度，K，即273+t（測定時攝氏溫度），s為滲透勢，單位為MPa

11、（1大氣壓=1.013105Pa）。如何知道那一濃度蔗糖溶液的水勢相等呢？我們知道，水勢的高低決定了水分的流動方向。若將植物細(xì)胞浸于蔗糖溶液中，當(dāng)植物細(xì)胞的水勢大于外界蔗糖溶液的水勢時，細(xì)胞失水，外界溶液相對密度變??；當(dāng)植物細(xì)胞的水勢小于外界蔗糖溶液的水勢時，細(xì)胞吸水，外界溶液的相對密度變大；只有當(dāng)植物細(xì)胞的水勢與外界蔗糖溶液的水勢相等時，植物細(xì)胞將既不吸水又不失水（實(shí)際情況應(yīng)是吸水和失水達(dá)到動態(tài)平衡），而蔗糖溶液的相對密度將不發(fā)生變化。因此，測定外界蔗糖溶液的相對密度變化就可確定那一濃度的蔗糖溶液的水勢與植物細(xì)胞的水勢相等。測定蔗糖溶液相度密度的變化，可采用如下簡便的方法：即利用毛細(xì)管吸取已

12、浸過植物組織的蔗糖溶液（為便于觀察，可用甲烯藍(lán)先染上顏色），放一小滴到與其對應(yīng)的相同濃度的蔗糖溶液中，然后觀察滴出的小液滴（藍(lán)色）的移動方向，即可知道浸過植物細(xì)胞的蔗糖溶液相對密度的變化（“小液流法”即由此而來）。若小液滴向上移動，這表示浸過植物組織的蔗糖溶液的相對密度變??；相反，向下移動，這表示相對密度變大；若靜止不動，這表示相對密度未變化，說明該濃度蔗糖溶液的水勢與植物組織的水勢相等。二、實(shí)驗(yàn)材料 馬鈴薯塊，小白菜或其他植物的葉片。三、實(shí)驗(yàn)用品1、儀器設(shè)備試管架，5ml帶塞試管8支、10ml帶塞試管8支、毛細(xì)管8支移液管（1 0 l）8 支，吸球1個，帶有橡皮管的注射針頭（或毛細(xì)管）8支

13、打孔器（內(nèi)徑1cm ） 1 只 解剖針1 支，小鑷子1 把， 2、藥劑（1）配制1mol/Kg蔗糖溶液（稱取預(yù)先在6080下烘干的蔗糖34.23g,溶于100g蒸餾水中，即為1質(zhì)量摩爾濃度的蔗糖溶液），然后稀釋成一系列濃度遞增的蔗糖溶液（0.1mol/Kg，0.2mol/Kg，0.3mol/Kg，0.4mol/Kg，0.5mol/Kg，0.6mol/Kg，0.7mol/Kg，0.8mol/Kg）。（2）甲烯藍(lán)粉末。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容小液流法測定馬鈴薯塊莖的水勢。五、實(shí)驗(yàn)步驟取8支10ml的帶塞試管，順序編上號，依次分別加入5ml濃度遞增的蔗糖溶液，蓋上塞子，順序放在試管架上，作為觀察組。所用試管一定

14、要干燥。2另取8支10ml的帶塞試管對應(yīng)于觀察組各管編號， 并加入對應(yīng)于觀察組的濃度遞增蔗糖溶液5ml，蓋上塞子，順序放在試管架上作為試驗(yàn)組。打孔器將馬鈴薯塊莖打取長條（41cm），用蒸餾水迅速沖洗，然后用濾紙吸干表面水分。將馬鈴薯塊莖長條分別放入試驗(yàn)組各管，蓋上塞子，經(jīng)過一定時間（約在30分鐘以上），分別用解剖針取出馬鈴薯塊莖條，再用解剖針尖沾少許次甲基藍(lán)粉末（不可加多）放入溶液，輕微搖動，使次甲基藍(lán)溶解，溶液呈淺藍(lán)色即可。 或2用移液管從10ml試管中，取出不同濃度的蔗糖溶液1ml，分別裝入相對應(yīng)的5ml試管中，立即加塞。移液管與濃度一一對應(yīng)。取生長狀態(tài)一致的植物葉片數(shù)片（擦干表面水分），

15、在葉片的相同部位（應(yīng)避免葉脈）用打孔器打取小圓片，用鑷子向5ml試管中各投入10片，使溶液浸沒小圓片，加色放置約30min，其間經(jīng)常搖動小試管，并保持小圓片浸沒于溶液中。打取小圓片及投入試管中時，動作應(yīng)盡量快速。用注射針頭分別吸取試驗(yàn)組各管的藍(lán)色溶液放入對照組同樣濃度溶液的中部，輕輕放出一滴藍(lán)液，輕輕取出針頭，觀察藍(lán)色液滴移動的方向，是向上，向下還是不動（每次測定均要用待測濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶液清洗幾次注射針頭）。如此方法檢查各管中液滴的升降動向。若液滴上升，說明浸過小圓片的蔗糖溶液濃度變?。粗参锝M織失水），表明葉片組織的水勢高于該濃度溶液的滲透勢；若藍(lán)色液滴下降，這說明葉片組織的水勢低于該濃

16、度溶液的滲透勢；若藍(lán)色液滴靜止不動，則說明葉片組織的水勢等于該濃度溶液的滲透勢；如果在前一濃度溶液中下降，而在后一濃度溶液中上升，則葉片組織的水勢即為二種濃度溶液的滲透勢的平均值。將藍(lán)色小液滴移動方向填入下表中。按i1.0計算溶液的滲透勢和馬鈴薯塊莖的水勢。表1 小液流法現(xiàn)象觀察記載表蔗糖濃度（mol/L）0.10.20.30.40.50.60.70.8小液流移動方向 7記錄實(shí)驗(yàn)時的溫度。六、綜合分析1用小液流法測定植物組織水勢時，如何根據(jù)小液流的方向判斷水勢？原理是什么？2用注射針頭將試驗(yàn)組的藍(lán)色液滴放入觀察組時，為什么要輕輕放出一滴藍(lán)液，然后又輕輕取出注射針頭？實(shí)驗(yàn)2 不良環(huán)境對植物生理生

17、化的影響（設(shè)計性實(shí)驗(yàn)，8學(xué)時）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握溫度和水分逆境與植物生理生化變化的基本原理 2學(xué)會基質(zhì)栽培植物的常規(guī)管理方法 4掌握溫度和水分逆境的處理方法 5掌握逆境處理后相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定方法二、基本要求1每2位學(xué)生一組，分工明確，互相協(xié)作 2每組實(shí)驗(yàn)材料由學(xué)生確定 3每組學(xué)生必須完成1種植物的基質(zhì)栽培、2種逆境處理并測定2項生理生化指標(biāo) 4正式實(shí)驗(yàn)前一周，每組交實(shí)驗(yàn)可行性報告一份，經(jīng)指導(dǎo)教師審閱批準(zhǔn)后，方可開始實(shí)驗(yàn)?？尚行詧蟾姹仨毎ㄒ韵聝?nèi)容。 （1）實(shí)驗(yàn)原理 （2）確定的實(shí)驗(yàn)材料：包括植物材料，所需儀器、藥品等。 （3）實(shí)驗(yàn)步驟 （4）實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果 5本次實(shí)驗(yàn)要求在6周內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)

18、完成后，每位學(xué)生必須交實(shí)驗(yàn)報告一份。實(shí)驗(yàn)報告的基本格式如下： （1）實(shí)驗(yàn)題目：組員姓名，班級，指導(dǎo)教師姓名 （2）實(shí)驗(yàn)原理 （3）材料與方法 （4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 （5）討論 （6）參考文獻(xiàn)三、實(shí)驗(yàn)學(xué)時 8學(xué)時四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一) 溫度逆境對植物的影響（1）取植物材料，用蒸餾水漂洗，分三組，每組1g，分別裝入三角燒瓶中。第一組放在45溫箱中，第二組放在冰箱中，第三組放在室溫條件下。（2）一小時后，取出三組三角燒瓶，用電導(dǎo)率儀測量每一組三角燒瓶中溶液的電導(dǎo)度。（實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)28）（3）用蒽酮試劑測定可溶性糖滲出量。（實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)22）(二) 水分逆境對植物的影響（1）繪制脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。配0、

19、5.0、10、15、20、25、30ug/ml的脯氨酸梯度溶液各2ml，分別加冰醋酸2ml，茚三酮試劑2ml加入試管中，用橡皮塞塞緊，于沸水浴中15分鐘，515nm下比色。（2）植株樣品液的提取，分別提取不同水分條件下的植株樣品中的脯氨酸。（3）游離脯氨酸含量的測定。（實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)28）（4）過氧化物酶活性和過氧化氫酶活性的測定。（實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)24、實(shí)驗(yàn)25）五、綜合分析 1、比較不同條件對植物傷害狀況。2、比較不同水分條件下植物體內(nèi)脯氨酸含量和酶活性的變化。 3、簡述蒽酮比色法進(jìn)行植物組織中可溶性糖含量測定的實(shí)驗(yàn)原理。 4、如何用蒽酮比色法測定植物組織中的可溶性糖含量？5、影響過氧化氫酶

20、活性測定的因素有哪些？6、過氧化物酶與哪些生化過程有關(guān)？7、如何用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶的活性？實(shí)驗(yàn)28 植物抗寒性的鑒定在低于生長適宜溫度以下生長時，作物往往要遭受一定程度的危害。一般0以上低溫對作物所造成的危害叫冷害（chilling injury)；冰點(diǎn)以下的低溫引起的傷害叫凍害（freezing injury）。在低溫的影響下，植物體內(nèi)會發(fā)生光合作用減弱，呼吸代謝失調(diào)，細(xì)胞膜勸吸收能力下降，物質(zhì)代謝失調(diào)等現(xiàn)象。通過對植物在低溫下各種反應(yīng)的研究，可以探明在低溫不良環(huán)境下的受傷程度及生長發(fā)育規(guī)律，并加以人工調(diào)控，對農(nóng)業(yè)高產(chǎn)具有穩(wěn)定意義。如上所述，植物在低溫下有許多不正常的表現(xiàn)，相應(yīng)地

21、也有很多對植物低溫下受到傷害的測式方法，但最常見和較為簡單的方法有植物細(xì)胞差別透性的測定和逆境下游離脯氨酸含量的測定兩種方法。第一部分、植物細(xì)胞差別透性的測定 一、目的和要求控制物質(zhì)出人細(xì)胞的性質(zhì)就是細(xì)胞的差別透性，細(xì)胞差別透性主要取決于質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)與功能。質(zhì)膜不僅是分隔細(xì)胞質(zhì)與胞外物質(zhì)的屏障，而且是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的主要通道，還是細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位。各種逆境，如高溫、低溫、干旱、水澇、鹽漬和大氣污染（O3、SO2）等的傷害，往往首先作用于質(zhì)膜上，造成質(zhì)膜差別透性的改變與喪失，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)（尤其是電解質(zhì)）大量外滲，導(dǎo)致組織浸泡液的電導(dǎo)率增大。膜結(jié)構(gòu)破壞的程度與低溫的嚴(yán)重程度、

22、待續(xù)的時間及作物品種的抗寒性等因素有關(guān)。通過測定外滲液電導(dǎo)率的變化即可反映出質(zhì)膜受害程度和植物抗性的強(qiáng)弱。因此，測定植物細(xì)胞的差別透性對于研究植物的抗性具有重要意義。本測定采用電導(dǎo)儀法，其原理是：小分子或生物大分子的電解質(zhì)水溶液均可導(dǎo)電，并服從歐姆定律，即在溶液中兩電極外加V伏電壓，流過的電流為A安培，則兩極內(nèi)的電阻為R歐姆（R=V/A）。若溶液的電阻大，電導(dǎo)能力就小，因此把溶液電阻的倒數(shù)定為溶液的電導(dǎo)，以S表示（S=1/R=A/V）。由此可見，測量電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)實(shí)際上是測其電阻。對電解質(zhì)溶液而言，取面積1 cm2的兩片電極，相距1 cm，中間的1 cm3溶液所表現(xiàn)出來的電導(dǎo)稱該溶液的比電導(dǎo)

23、，也叫電導(dǎo)率，用K表示（即K=QS），其單位為S/ cm，但實(shí)際應(yīng)用時多采用uS/cm；式中的Q為電極常數(shù)，由廠家測定后標(biāo)在電極上，使用時應(yīng)加以注意，當(dāng)不知道其值時可參照電導(dǎo)率儀使用說明書的附錄進(jìn)行測定。二、材料和用具1材料玉米、小麥、水稻、大豆或其他植物的葉片。2儀器電導(dǎo)儀、分析天平、真空泵、真空干燥器、恒溫水浴、水浴鍋、溫箱、冰箱、振蕩器、負(fù)壓表，洗瓶、打孔器、剪刀、定距切割器、燒杯、具蓋白瓷板、具塞三角瓶。3試劑洗液、去污粉、去離子水。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1用具清洗由于電導(dǎo)變化極為敏感，因此所用玻璃器具必須干凈，先用去污粉（或洗液）洗滌，再用自來去離子水沖洗，然后倒置于墊有濾紙的干凈瓷盤中，用紗

24、布蓋好。2材料準(zhǔn)備根據(jù)測定需要量，剪取相同葉齡，相同葉位、長勢一致的葉片（或其他器官），用濕紗布包好帶回室內(nèi)。試材先用自來水再用去離子水沖洗，后用濾紙吸干外附水分，置于墊有濕潤濾紙的瓷盤內(nèi)。接著，將窄葉（小麥、水稻）剪成1 cm切段，將闊葉（大豆、向日葵）打成直徑為0. 5-1.0cm葉圓片，并用去離子水沖洗（除去傷口外流物質(zhì)）和吸干外附水分；而小葉（三葉草）即用完整側(cè)葉，立即稱重備用。 3電解質(zhì)浸提 準(zhǔn)確稱取上述材料0. 1-1. 0 g裝人具塞三角瓶或燒杯中，加去離子水10-30 mL，為使葉片完全浸人水中，可用真空泵抽氣10-30 min，于室溫下浸泡4-5 h, 4.電導(dǎo)率測定 先將各

25、管浸泡液上下攪拌或搖勻，然后再測電導(dǎo)率值。為了測定相對外滲電導(dǎo)率值，需將測過電導(dǎo)率的各管（浸泡液及材料）于沸水中煮沸1020 min，冷卻至室溫后再測一次總電導(dǎo)率值。 5結(jié)果計算、電解質(zhì)外滲率有三種表示方法： K1K2 (1) 外滲電導(dǎo)率值 直接用電導(dǎo)率值表示，按照公式M=計算。 WV 式中：M一電解質(zhì)外滲率，) uS/(cm。g。mL) ; K1一樣品浸提液電導(dǎo)率值，uS/ cm; W一樣品質(zhì)量，g; K2一去離子水電導(dǎo)率值，uS/cm; V一樣品浸提液體積，Ml。 (2)電解質(zhì)相對滲出率為消除測定中的各種誤差，并便于比較，可采用相對值表示： 浸泡液電導(dǎo)率值 電解質(zhì)滲透= 100% 煮沸后電

26、導(dǎo)率值 . 處理電導(dǎo)率值一本底電導(dǎo)率值 電解質(zhì)相對滲出率= 100 % 對照電導(dǎo)率值一本底電導(dǎo)率值 處理電導(dǎo)率值一對照電導(dǎo)率值 傷害率 處理煮沸后電導(dǎo)率值對照電導(dǎo)率值 (3)電解質(zhì)絕對滲出量按照公式M=AV/W 式中：M電解質(zhì)滲出量，mg/g A一以樣品電導(dǎo)率值與本底電導(dǎo)率值之差在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得電解質(zhì)，u.g/mL; W一樣品質(zhì)量，g； V一樣品浸提液體積，mL, 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法：配制0. 01-10 mmol/L KCl(A. R）溶液，于25下測其電導(dǎo)率值，以電導(dǎo)率（uS/ cm）為縱坐標(biāo)，以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、注意事項 由于溶液的電導(dǎo)率受溫度影響較大（據(jù)測定

27、，溫度每升高1電導(dǎo)約增加2%)。為此，可照公式XZ5 =Mt 1+0. 02(t-25)進(jìn)行校正，式中：X25一校正至25時的電導(dǎo)率值； t一測定時溶液溫度；Mt一于t下實(shí)測的電導(dǎo)率值；0.02-溶液升溫I電導(dǎo)率增值。五、思考題1計算不同處理的植物樣品的相對電導(dǎo)率。2分析溫度對作物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的傷害作用，溫度與細(xì)胞電解質(zhì)相對外滲率的關(guān)系。3以電導(dǎo)或相對電導(dǎo)率作為抗寒性的指標(biāo)，哪個更好些？為什么？第二部分、逆境下游離脯氨酸含量的測定 在正常條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量并不高200-700 ug/g(干重）約占游離氨基酸總量的百分之幾。但當(dāng)植物處于低溫、高溫、干旱、鹽漬、大氣污染等逆境下時組織內(nèi)

28、的游離脯氨的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，能夠保護(hù)酶的空間結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定膜系統(tǒng)，參與葉綠素合成，消除NH3的毒害，因而提高了植物的抗性。因此，測定植物體內(nèi)游離氨基酸的含量，在一定程度上可了解植物受環(huán)境脅迫的情況，了解植物對低溫等脅迫的忍耐和抵抗能力，在生產(chǎn)上和育種學(xué)上都有一定的意義。 一、原理 游離氨基酸與茚三酮共熱時，能定量地生成二酮茚一二酮茚胺。該產(chǎn)物顯示藍(lán)紫色，稱為Ruhemans紫。其吸收峰在570 nm，而且在一定范圍內(nèi)吸光度與游離氨基酸濃度成正比，因此可用分光光度法測定其含量。氨基酸與茍三酮的反應(yīng)分兩步進(jìn)行，第一步：氨基酸被氧化形成CO2 ,NH3和醛，茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步：所形成

29、的還原型茚三酮與另一分子茚三酮和一分子氨進(jìn)行縮合脫水，生成二酮茚一二酮茚胺。反應(yīng)式如下：該反應(yīng)有以下特點(diǎn)：1由于該反應(yīng)的第一步是茚三酮的還原，而還原型茚三酮在含氧量高的情況下很容易再氧化，對反應(yīng)有干擾，因此，常在反應(yīng)體系中加人還原劑，以阻止還原型茚三酮的再氧化。曾被使用的還原劑有氯化亞錫、抗壞血酸及氰酸鹽等。前兩者顯色反應(yīng)不穩(wěn)定，抗壞血酸溶液在空氣中易被氧化，必須現(xiàn)用現(xiàn)配，還可與茚三酮發(fā)生顏色反應(yīng)而干擾測定結(jié)果。三種還原劑中，以氰酸鹽最理想，不但顯色穩(wěn)定，而且還可將它事先加人緩沖液中，以防止緩沖液發(fā)霉變質(zhì)，延長使用時間，故本實(shí)驗(yàn)采用氰酸鹽作還原劑。2該反應(yīng)需要脫水縮合，反應(yīng)介質(zhì)中水的多少不但對

30、終點(diǎn)產(chǎn)物的濃度有很大影響，而且還會影響終點(diǎn)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。所以，反應(yīng)完畢后應(yīng)在反應(yīng)體系中定量加人有機(jī)溶劑，以穩(wěn)定反應(yīng)產(chǎn)物。 3反應(yīng)中有氨基酸分解產(chǎn)生的氨參與茚三酮的縮合，所以氨能強(qiáng)烈干擾該反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時應(yīng)保證測定用水和各種試劑不被氨所污染。 4由于蛋白質(zhì)和多肽中的游離氨基酸也會產(chǎn)生同樣反應(yīng)，因此，對于含大量蛋白質(zhì)和多肽的樣品，應(yīng)先用蛋白質(zhì)沉淀劑將其除去。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有10乙酸、磺基水楊酸(SSA)、三氯乙酸（TCA)、過氯酸（PCA）等，其中以乙酸提取總氨基酸的效果較好。故為本實(shí)驗(yàn)所采用。 5該反應(yīng)體系在有機(jī)溶劑系統(tǒng)中穩(wěn)定性良好，且最適pH為4.5，此條件下其吸光度十幾小時內(nèi)無明顯變化。故本

31、實(shí)驗(yàn)選擇在乙醇一乙酸鈉緩沖液（pH 5. 4)中進(jìn)行。 二、材料、儀器設(shè)備及試劑 （一）材料 各種植物組織。（二）儀器設(shè)備 722型分光光度計；分析天平（感量0. 01 g) ;研缽；容量瓶；試管；水浴鍋；三角瓶；漏斗。 （三）試劑 1水合茚三酮試劑稱取0. 6 g再結(jié)晶的茚三酮置燒杯中，加人15 mL正丙醇，攪拌使其溶解。再加人30 mL正丁醇及60 mL乙二醇，最后加人pH 5.4的乙醇一乙酸鈉緩沖液9 mL，混勻，貯于棕色瓶，置于4下保存?zhèn)溆茫?0 d內(nèi)有效。 2乙醇一乙酸鈉緩沖液（pH 5. 4)稱取乙酸鈉54. 4 g加人100 mL無氨蒸餾水，在電爐上加熱至沸騰，使體積蒸發(fā)至60

32、mL左右。冷卻后轉(zhuǎn)人100 mL容量瓶中加30 mL冰醋酸，再用無氨蒸餾水稀釋至100 mLo 3.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液稱取80下烘干的亮氨酸46. 8 mg，溶于少量10異丙醇中，用10異丙醇定容至100 mL，即為1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸儲備液，置冰箱中保存。取此液5 mL，用蒸餾水稀釋至50 mL，即為含5 ug/mL氨基氮之標(biāo)準(zhǔn)液。 4.氰化鈉儲備液稱取490 mg NaCN，溶于1L無氨蒸餾水中，濃度為0.01 mol/Lo 5. 10乙酸。 6乙酸一氰酸鹽緩沖液取0. 01 mol/L的NaCN儲備液20 mL，用乙醇一乙酸鈉緩沖液稀釋至1 L，該緩沖液中NaCN 0. 000 2 m

33、ol/L，可在室溫下保存數(shù)月。三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）樣品制備 取新鮮植物樣品，洗滌、擦干并剪碎、混勻后，迅速稱取0.51.0 g，于研缽中加人5 mL10乙酸，研磨勻漿后，用蒸餾水稀釋至100 mL?；靹?，并用干濾紙過濾到三角瓶中備用。 （二）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取6支20 mL刻度試管，按表1操作。 加完試劑后混勻，蓋上大小合適的玻璃球，置沸水中加熱15 min，取出后用冷水迅速冷卻并不時搖動，使加熱時形成的紅色被空氣逐漸氧化而褪去，進(jìn)而呈現(xiàn)藍(lán)紫色時，用60乙醇定容至20 mL?；靹蚝笥? cm光徑比色皿在570波長下測定吸光度（以1號空白管為參比），以氨基酸微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)

34、準(zhǔn)曲線，并求出其直線回歸方程。 表1 制作游離氮基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線各試劑量及操作程序試劑管號123456氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 /mL0.00.20.40.6無氨蒸餾水/mL2.01.81.61.4水合茚三酮/mL3.03.03.03.03.03.0乙酸一氰酸鹽緩沖液/mL0.50.50.50.50.50.5每管游離氨基酸含量/g0.01.02.03.04.05.0（三）樣品測定 吸收樣品濾液l. 0 mL（其中氨基酸總量不應(yīng)大于5. 0 mL，否則應(yīng)稀釋后測定），放入20 mL干燥試管中，再加入無氨蒸餾水l. 0 mL，接著加人0. 5 mL乙酸一氰酸鹽緩沖液和3. 0 mL水合茚三酮，然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

35、步驟顯色、比色，根據(jù)樣品吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或用回歸方程計算出樣品濾液中的含氮量。 四、結(jié)果計算按下式計算樣品中氨基態(tài)氮的含量： CVT 樣品氨基態(tài)氮含量（ug/l00 g）= 100 VsW 式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基態(tài)氮含量，ug; VT為樣品總體積，mL; Vs為測定時取用的樣品體積，mL; W為樣品鮮質(zhì)量，g。 五、注意事項 1. 茚三酮重結(jié)晶的方法合格的 茚三酮應(yīng)該是微黃色結(jié)晶，若保管不當(dāng)，顏色加深或變成微紅色，必須重結(jié)晶后方可使用。其方法如下：5g 茚三酮溶于15 mL熱蒸餾水中，加入0.25 g活性炭，輕輕搖動，溶液太稠時，可適量加水，30 min后用濾紙過濾，濾液置冰箱

36、中過夜后即可見微黃色結(jié)晶析出，用干濾紙過濾，再用1 mL蒸餾水洗結(jié)晶一次，置于干燥器中干燥后貯于棕色瓶中。 2. 茚三酮與氨基酸反應(yīng)所生成的二酮茚一二酮茚胺在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，故稀釋后盡快比色。 3空氣中的氧干擾顯色反應(yīng)的第一步。因?yàn)镹aCN為劇毒品，故一般在不太嚴(yán)格時以抗壞血酸為還原劑，雖也可提高反應(yīng)的靈敏度，并使顏色穩(wěn)定，但由于抗壞血酸也可與茚三酮反應(yīng)，使溶液顏色過深，故應(yīng)嚴(yán)格掌握加人抗壞血酸的量。 4反應(yīng)溫度影響顯色穩(wěn)定性，超過80，溶液易褪色；可在80水浴中加熱，并適當(dāng)延長反應(yīng)時間，效果良好。 5谷物籽實(shí)等含蛋白質(zhì)的樣品可用酸水解法將蛋白質(zhì)水解后，用本法測定水解液中的氨基酸含量，可計算出

37、樣品蛋白質(zhì)含量。六 、思考題 1植物體內(nèi)游離脯氨酸的測定有何意義？ 2根據(jù)樣品測定的結(jié)果、稀釋倍數(shù)和質(zhì)量，計算各處理的每克植物鮮重及干重樣品中游離脯氨酸的平均含量。3.根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析低溫與植物體內(nèi)游離脯氨酸積累的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)24 愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶活性 過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關(guān)系，在植物生長發(fā)育過程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。 一、原理 在過氧化物酶(peroxidase）催化下，HZ O：將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470 nm有最大光吸收，故通過測

38、470 nm下的吸光度變化就可以測定過氧化物酶的活性。二、材料、儀器設(shè)備及試劑 （一）材料 馬鈴薯塊莖。 （二）儀器設(shè)備 可見光分光光度計；離心機(jī)；研缽；容量瓶；量筒；試管；吸管。 （三）試劑 1. 0. 05 mol/L pH 5. 5磷酸緩沖液。 2. 0. 05 mol/L愈創(chuàng)木酚。 3. 2H2O2。 4. 20三氯乙酸。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液的制備 取5. 0 g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放人研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3 000 rmp離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提取2次，上清液并人容量瓶中，定容

39、至刻度，低溫下保存?zhèn)溆谩?（二）過氧化物酶活性測定 酶活性測定的反應(yīng)體系包括：0. 05 mol/L磷酸緩沖液2.9 mL,2% H2O2 1.0 mL,0. 05 mol/L愈創(chuàng)木酚1. 0 mL和0. 1 mL酶液。用加熱煮沸5 min的酶液為對照，反應(yīng)體系加人酶液后，立即于37水浴中保溫15 min，然后迅速轉(zhuǎn)人冰浴中，并加入20三氯乙酸2. 0 mL終止反應(yīng)，然后過濾（或5 000 r/min離心10 min)，適當(dāng)稀釋，470 nm波長下測定吸光度。四、結(jié)果計算以每分鐘A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U), A470VT 過氧化物酶活性U/(g。min）= WVs0.0

40、1t式中：A470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為馬鈴薯鮮質(zhì)量（g);t為反應(yīng)時間（min) ; VT為提取酶液總體積（mL); Vs為測定時取用酶液體積（mL) 。 五、思考題 1簡述測定過氧化物酶活性的生理意義。 2本測定方法有哪些需要改進(jìn)的地方？ 實(shí)驗(yàn)25 過氧化氫酶活性測定 過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測定。 1 紫外吸收法 一、原理 H2O2：在240 nm下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度A240隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測定吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。 二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）

41、材料 小麥葉片等。（二）儀器設(shè)備 研缽；離心機(jī)；250 mL容量瓶；移液管（0. 5 mL, 2 mL各2支）；10 mL試管3支；恒溫水??；紫外分光光度計。（三）試劑 1. 0. 2 mol/L pH 7. 8磷酸緩沖液（內(nèi)含1聚乙烯毗咯烷酮）。 2. 0. 02 mol/L H202（使用前用0. 1 mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定）。 三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提取取小麥葉片0. 5 g加人2-3 mL 4下預(yù)冷的pH 7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液至容量瓶中并定容至刻度?；旌暇鶆蚝髮⑷萘科恐?冰箱中靜置10 min，取上部

42、清液于4 000 r/min下離心15 min，上清液即為過氧化氫酶粗提液，5下保存?zhèn)溆?。（二）酶活性測定 取10 mL試管3支，其中2支樣品測定管，1支為對照空白管，按下表順序加人試劑。 表1 紫外吸收法測定H202樣品液配置表 將S。號管在沸水浴煮1 min以殺死酶液，冷卻。然后將所有試管在25下預(yù)熱后，逐管加人0.3 mL 0. 1 mol/L的H202，每加完一管立即計時，并迅速倒人石英比色皿中，在240 nm下測定吸光度，每間隔1 min讀數(shù)1次，共測4 min，待3支管全部測定完后，計算酶活性。四、結(jié)果計算 以每分鐘A240減少0.1的酶量為1個酶活性單位（U) 。 A240VT

43、過氧化氫酶活性U/(g.min)= 0.1VstW （AS1+AS2）其中A240=AS0 2 式中：AS0為加人煮死酶液的對照管的吸光度；AS1 ,AS2為樣品測定管的吸光度；V：為提取酶液總體積（mL) ; Vs為測定時所用酶液體積（mL);W為樣品鮮質(zhì)量（g) ;t為從加H2O2開始到最后一次讀數(shù)的時間（min); 0. 1為A240下降01時的1個酶活性單位（U). 【注】所用H2O 2溶液及KMn04溶液臨用前需重新標(biāo)定。 注意事項 凡在240 nm下有強(qiáng)烈吸收的物質(zhì)都對本實(shí)驗(yàn)有干擾。 2 高錳酸鉀滴定法一、原理 過氧化氫酶(catalase）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫

44、分解為水和氧分子，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。可根據(jù)H2O2的消耗量或02的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加人一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。即可求出消耗的H202的量。 5H202十2KMnO4十4H2 SO45O2十2KHSO4十9H20+2MnSO4二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料 小麥葉片。（二）儀器設(shè)備 研缽；三角瓶；酸式滴定管；恒溫水??；容量瓶。（三）試劑 1. 10 H2 SO4。 2. 0.2 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液。 3. 0. 02 mol/L高錳酸鉀標(biāo)

45、準(zhǔn)液 取KMnO4 (AR) 3.160 5 g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1 000 mL，再用0. 1 mol/L草酸溶液標(biāo)定。 40.1 mol/L H2O2: 取30% H2O2溶液5.68 mL，稀釋至1 000 mL，用標(biāo)準(zhǔn)0. 02 mol/LKMn04溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定。 5. 0. 1 mol/L草酸取優(yōu)級純H2C2O4 2H20 12. 607 g，用蒸餾水溶解后定容至1 000 mL。 三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提取 取小麥葉片 2. 5 g加入pH 7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中，用同一緩沖

46、液定容，4 000 r/min離心15 min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。（二）取50 mL三角瓶4個（兩個測定，另兩個為對照），測定瓶加入酶液2. 5 mL，對照加煮死酶液2.5 mL，再加入0. 1 mol/L H202 2. 5 mL，同時計時，于30恒溫水浴中保溫10 min，立即加人10% H2 S04 2. 5 mL。（三）用0. 02 mol/LKMn04標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（在30 s內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。四、結(jié)果計算 酶活性用每g鮮質(zhì)量樣品1 min內(nèi)分解H2O2的mg數(shù)表示： VT （A-B）1.7 VS 過氧化氫酶活性U/(g.min)= Wt 式中：A為對照滴定K

47、MnO4的mL數(shù)；B為酶反應(yīng)后滴定KMnO4滴定的mL數(shù)；VT為提取酶液總量（mL) ; VS為反應(yīng)時所用酶液量（mL) ; W為樣品鮮質(zhì)量（g);t為反應(yīng)時間（min); 1. 7為0. 02 mol/L KMnO4 1 mL相當(dāng)于1. 7 mgH202 注KMnO4溶液及H202溶液臨用前要經(jīng)過重新標(biāo)定。五、思考題1影響過氧化氫酶活性測定的因素有哪些？2過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)？實(shí)驗(yàn)22 植物組織中可溶性糖含量的測定（蒽酮比色法）一、原理 糖（sugar）在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糖醛或烴甲基糠醛，生成的糠醛或烴甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與

48、糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)，在可見光區(qū)的吸收峰為630 nm，可在此波長下比色。該法的特點(diǎn)是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊塘與己糖，而且可以測寡糖類和多糖類，其中包括蔗糖、淀粉、纖維素等（因?yàn)榉磻?yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)），所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以依次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因?yàn)榧?xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)

49、而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深淺不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一） 材料新鮮或烘干的植物葉片。（二） 儀器設(shè)備 分光光度計，水浴鍋，刻度試管，刻度吸管。（三） 試劑 （1）蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1 g，溶于50 mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，在黑暗中可保存數(shù)星期，如有結(jié)晶析出，可微熱溶解。 （2）濃硫酸（比重1.84）。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）1蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液將分析純蔗糖在80下烘至恒重，精確稱取1.0

50、00 g。加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100 mL溶量瓶中，加入0.5 mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。（2）100 gL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液精確吸收1蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1 mL加入100 mL溶量瓶中，加水至刻度。取20 mL刻度試管11支，從010分別編號，按下表加入溶液和水。然后按順序向試管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管均準(zhǔn)確保溫1 min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630 nm 波長下測其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。表 蒽酮法測可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑量試劑管號01、23、45、67、89、101

51、00 gL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液 (mL)00.20.40.60.81.0水(mL)2.01.81.61.41.21.0蔗糖量/g020406080100（二） 可溶性糖的提取取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.100.30 g，共3份，或干材料。分別放入3支刻度試管中，加入510 mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2次），提取液過濾入25 mL容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘渣，定容至刻度。（三） 顯色測定吸取樣品提取液0.5 mL于20 mL刻度試管中（重復(fù)三次），加蒸餾水1.5 mL，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定相同，測定樣品的吸光度，計算可溶性糖的含量。四、結(jié)果計算由標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出糖的量（g），按下式計算測試樣品的糖含量。 從回歸方程求得糖的量 提取液量稀釋倍數(shù) 吸取樣品液的體積可溶性糖含量100 樣品干重106四、注意事