DNA測(cè)序原理和方式

1、DNA測(cè)序原理和方式DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序，手工測(cè)序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序事實(shí)上已成為現(xiàn)今DNA序列分析的主流。美國(guó)PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測(cè)序儀，其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中利用最多的一種型號(hào)。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABIPRISM310型DNA測(cè)序儀的測(cè)序原理和操作規(guī)程。【原理】ABIPRISM310型基因分析儀（即DNA測(cè)序儀），采納毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP（標(biāo)記終止物法），因此通過(guò)單引物PCR測(cè)序反映，生

2、成的PCR產(chǎn)物那么是相差1個(gè)堿基的3”結(jié)尾為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而幸免了泳道間遷移率不同的阻礙，大大提高了測(cè)序的精準(zhǔn)度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過(guò)毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測(cè)器窗口中的CCD（charge-coupleddevice）攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變成DNA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出

3、。它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測(cè)定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測(cè)序膠（POP6）和GeneScan月（POP4）。這些凝膠顆?？讖骄?，幸免了配膠條件不一致對(duì)測(cè)序精度的阻礙。它要緊由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中那么包括資料搜集， 分析和儀器運(yùn)行等軟件。 它利用最新的CCD攝影機(jī)檢測(cè)器， 使DNA測(cè)序縮短至，PCR片段大小分析和定量分析為1040min。由于該儀器具有DNA測(cè)序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測(cè)序、雜合子分析、單鏈構(gòu)

4、象多態(tài)性分析（SSCP）、微衛(wèi)星序列分析、長(zhǎng)片段PCR、RT-PCR（定量PCR）等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外，還可進(jìn)行單核昔酸多態(tài)性（SNP）分析、基因突變檢測(cè)、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等?！驹噭┡c器材】1.BigDye測(cè) 序 反 應(yīng) 試 劑 盒 要 緊 試 劑 是BigDyeMix,內(nèi) 含PE專 利 四 色 熒 光 標(biāo) 記 的ddNTP和 一 般dNTP,AmpliTaqDNApolymeraseFS,反映緩沖液等。2.pGEM-3Zf（+）雙鏈DNA對(duì)照模板L,試劑盒配套試劑。3.M13（-21）引物TGTAAAACGACGGCCAGT,g

5、mol/L，即l,試劑盒配套試劑。4. DNA測(cè)序模板能夠是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反映時(shí)取量1從的宜。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA,濃度為L(zhǎng),即200ng/gl。5.引物需依照所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物， 配制成gmol/L即從l。 如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13（-21）引物，T7引物等。6.滅菌去離子水或三蒸水。7.或和的PCR管蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。8.3mol/L醋酸鈉稱取NaAc-3H2cm于70ml蒸儲(chǔ)水中，冰醋酸調(diào)pH至，定容至100ml,高壓滅菌后分裝。9.70%乙醇和無(wú)水乙醇。10.NaAc/乙醇混合液取無(wú)水乙

6、醇和3mol/LNaAc混勻，室溫可保留1年。11.POP6測(cè)序膠ABI產(chǎn)品。12.模板抑制試劑(TSR)ABI產(chǎn)品。13.10X電泳緩沖液ABI產(chǎn)品。14.ABIPRISM310型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀。15.2400型或9600型PCR儀。16.臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)。17.臺(tái)式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)。【操作步驟】1 .PCR測(cè)序反應(yīng)(1)取的PCR管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：所加試劑測(cè)定模板管標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管BigDyeMix1gl11待測(cè)的質(zhì)粒DNA1glpGEM-3Zf(+)雙鏈DNA11待測(cè)DNA的正向引物1glM13(-21)引物一1I滅菌去離子水2Rl2Ml總反應(yīng)體積5

7、gl,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98C變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為9610s,50C5s,60C4min,25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增終止后設(shè)置4c保溫2.醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物(1)將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到EP管中。加入25醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4c離心30min,警惕棄上清。(3)加70%(V/V)的乙醇50R洗滌沉淀2次。12000r/min于4c離心5min,警惕棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀1015min3 .電

8、泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理加入12R的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。(2)將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的PCR管中，稍離心。(3)在PCR儀上進(jìn)行熱變性(952min),冰中驟冷，待上機(jī)4 .上機(jī)操作按儀器操作說(shuō)明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和成立運(yùn)行的測(cè)序順序文件。儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，預(yù)電泳5min,按編程順序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳，20min）,在下電泳2h。電泳終止后儀器會(huì)自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個(gè)樣品電泳總時(shí)刻為。電泳終止后儀器會(huì)自動(dòng)分析或打印出彩色測(cè)序圖譜。5 .儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序

9、序列已知，可通過(guò)序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。6 .測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)?！居?jì)算】測(cè)序反應(yīng)精確度計(jì)算公式：100%差異堿基數(shù)（不包括N數(shù)）/650X100%差異堿基即測(cè)定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基?！咀⒁馐马?xiàng)與評(píng)價(jià)】1 .ABIPRISM310基因分析儀是高級(jí)周密儀器，需專人操作、治理和保護(hù)。2 .本實(shí)驗(yàn)測(cè)序PCR反應(yīng)的總體積是5gl,而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于4從l,則此CR反應(yīng)可能失敗，不必進(jìn)行純化和上樣。3.作為測(cè)序用戶來(lái)說(shuō)，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個(gè)測(cè)序PCR反應(yīng)使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測(cè)序所需模板的量較少，一般PCR產(chǎn)物需3090ng,單鏈DNA需50100ng,雙鏈DNA需200500ng,DNA的純度一般是A260nm/A280nm為,最好用去離子水或三蒸水溶解DNA,不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成較好。4 .本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒是BigDye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒，一般可測(cè)DNA長(zhǎng)度為650bp