無菌知識(shí)培訓(xùn)

1、無菌知識(shí)一.無菌相關(guān)的概念1.無菌：是指物體或任一介質(zhì)中沒有活的微生 物的存在，即無論用何種方法，檢不出活的微生物。2.無菌操作：指在操作中，采用或控制一定的條件，盡量避免產(chǎn)品污染微生物的一種操作方法程序。為此目的，所用的一切物料環(huán)境，均應(yīng)事先滅菌，操作也應(yīng)在無菌操作室中進(jìn)行。3.無菌觀念：指在無菌操作時(shí)，避免污染任何微生物?！盁o菌”從定義上來說是一個(gè)絕對(duì)的概念，但遺憾的是，科學(xué)和計(jì)數(shù)高度發(fā)展的今天，藥品的絕對(duì)無菌即做不到，也無法加以證實(shí)。然而，無菌制劑的安全性要求人們?cè)O(shè)定無菌的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。FDA、歐洲制藥工業(yè)界曾將百分之一微生物污染率作為美軍產(chǎn)品“無菌”的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，它和蒸汽滅菌后產(chǎn)品中微生物存

2、活的概率為10-6（即產(chǎn)品的無菌保證值為6），系同一標(biāo)準(zhǔn)的不同表示法。這一標(biāo)準(zhǔn)于1980起收錄于USP中，如今已為世界各國(guó)普遍接受和采用。二、細(xì)胞培養(yǎng)污染與檢測(cè) 細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、真菌、支原體和病毒。 無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等是主要的污染源。 嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。細(xì)胞培養(yǎng)過程中的主要細(xì)胞污染有：1、細(xì)菌污染2、真菌污染3、支原體污染4、病毒污染5、黑膠蟲污染（1）什么是細(xì)菌：細(xì)菌是一類細(xì)胞細(xì)短、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、胞壁堅(jiān)韌、多以二分裂方式繁殖和水生性較強(qiáng)的原核生物。（2）細(xì)菌分類：可根據(jù)形狀分為三

3、類，即：球菌、桿菌和螺旋菌（包括弧菌、螺菌、螺桿菌）。按細(xì)菌的生活方式來分類，分為兩大類：自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌，其中異養(yǎng)菌包括腐生菌和寄生菌。按細(xì)菌對(duì)氧氣的需求來分類，可分為需氧（完全需氧和微需氧）和厭氧（不完全厭氧、有氧耐受和完全厭氧）細(xì)菌。按細(xì)菌生存溫度分類，可分為喜冷、常溫和喜高溫三類。 也可經(jīng)革蘭氏染色法染色將細(xì)菌分為兩大類：一類最終染成紫色，稱為革蘭氏陽性細(xì)菌（G+），另一類被染成紅色，稱為革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）1、細(xì)菌污染（3）生存條件：凡在溫暖、潮濕和富含有機(jī)物質(zhì)的地方，都有各種細(xì)菌活動(dòng)之處。所需條件有： 溫度 ：在一定溫度范圍內(nèi)，細(xì)菌的代謝活動(dòng)和生長(zhǎng)繁殖隨著溫度的上升而加快。當(dāng)溫度升

4、高到一定限度，開始產(chǎn)生不良影響時(shí)，如果溫度繼續(xù)升高，細(xì)菌的細(xì)胞功能就會(huì)受到破壞，以致造成死亡。0停止生長(zhǎng)，在-20不會(huì)死亡 。 空氣濕度：65%75% 水分和空氣相對(duì)濕度：一般適合食用菌菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)料含水量在60左右。 空氣：微量的CO2濃度(0.0340.1) 光照：光照強(qiáng)度為2501000 Lux 5 pH值：喜偏酸性環(huán)境，菌絲生長(zhǎng)的pH值在36.5之間，最適pH值為5.05.5。大部分細(xì)菌在pH值大于7.0時(shí)生長(zhǎng)受阻，大于8.0時(shí)生長(zhǎng)停止。（4）細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，最常見的細(xì)菌污染主要有枯草桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，白色葡萄球菌也較常見。（5）細(xì)菌污染后，培養(yǎng)液p

5、H改變，培養(yǎng)液變得明顯混濁，也有的對(duì)培養(yǎng)液無肉眼可見影響，只在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌體時(shí)才知已污染，應(yīng)仔細(xì)觀察。2、真菌污染（1）什么是真菌：真菌是具有真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物，具有葉綠體但是無葉綠素不能進(jìn)行光合作用，具有發(fā)達(dá)的菌絲體，異樣吸收營(yíng)養(yǎng)，以產(chǎn)生大量無性和（或）有性孢子的方式進(jìn)行繁殖。大多數(shù)真菌生長(zhǎng)很快，而只有占少數(shù)的致病性真菌生長(zhǎng)較慢。（2）常見的主要有酵母菌、霉菌、煙曲霉、黑曲霉、孢子菌、白色念珠菌等（3）生存條件 真菌的生長(zhǎng)和繁殖受許多理化因素的影響 溫度是最能影響真菌生長(zhǎng)繁殖的因素。一般能容許真菌生長(zhǎng)的最低溫度為0-5，最高為40-45，最適宜淺部真菌生長(zhǎng)的溫度為22-28，最適宜深部

6、真菌生長(zhǎng)的溫度為37。 真菌的生長(zhǎng)繁殖需要一定的濕度，一般真菌在中等濕度時(shí)生長(zhǎng)較好。 真菌略偏嗜酸性，在PH5-7之間生長(zhǎng)最好。 絕大多數(shù)真菌生長(zhǎng)時(shí)需要氧氣，但需氧量不等。高壓氧能抑制真菌生長(zhǎng)，但不會(huì)至死。在氧供應(yīng)減少時(shí)真菌生長(zhǎng)緩慢。二氧化碳對(duì)皮膚癬菌生長(zhǎng)不利，但在一定條件下能刺激某些真菌的孢子形成。 真菌的生長(zhǎng)需要營(yíng)養(yǎng)成分，碳、氮、某些維生素和某些微量元素都是真菌生長(zhǎng)所不可缺少的。（4）真菌污染在細(xì)胞培養(yǎng)中較常見。真菌種類繁多，形態(tài)各異，但污染后易發(fā)現(xiàn)，肉眼可見培養(yǎng)基中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的呈散在生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁。倒置顯微鏡下觀察可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)于細(xì)胞

7、之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。3、支原體污染（1）什么是支原體：又稱霉形體，是一類無細(xì)胞壁、介于獨(dú)立生活和細(xì)胞內(nèi)寄生生活的最小型原核生物（2）繁殖方式多樣，主要為二分裂繁殖，還有斷裂、分枝、出芽等方式，蓋因缺乏細(xì)胞壁造成分支原體標(biāo)本裂時(shí)二個(gè)子細(xì)胞大小均所致。同時(shí)，支原體分裂和其DNA復(fù)制不同步，可形成多核長(zhǎng)絲體。（3）生產(chǎn)條件：營(yíng)養(yǎng)要求比一般細(xì)菌高，除基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還需加入1020%人或動(dòng)物血清以提供支原體所需的膽固醇。最適pH7.88.0之間，低于7.0則死亡。 大多數(shù)兼性厭氧，有些菌株在初分離時(shí)加入5%CO2生長(zhǎng)更好。生長(zhǎng)緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養(yǎng)基上孵育23天出現(xiàn)典型的“荷包蛋樣”

8、菌落：圓形（直徑1016um），核心部分較厚，向下長(zhǎng)入培養(yǎng)基，周邊為一層薄的透明顆粒區(qū)。（4）支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。（5）培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。4、病毒污染（1）什么是病毒是一種具有細(xì)胞感染性的亞顯微粒子，它實(shí)際上就是由一個(gè)保

9、護(hù)性的外殼包裹的一段DNA或者RNA，能以感染態(tài)和非感染態(tài)兩種狀態(tài)存在。（2）在宿主體內(nèi)時(shí)呈感染態(tài)（體細(xì)胞內(nèi)專性寄生），依賴宿主的代謝系統(tǒng)獲取能量、合成蛋白質(zhì)和復(fù)制核酸，然后通過核酸與蛋白質(zhì)的裝配而實(shí)現(xiàn)其大量繁殖；在離體條件下，不能繁殖，但是它們能以無生命的生物大分子狀態(tài)長(zhǎng)期存在，并可保持其侵染活性。（3）細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)有4種：無明顯反應(yīng)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增生后死亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化5、黑膠蟲（1）黑膠蟲概況： 在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，有時(shí)會(huì)在400倍顯微鏡下看到小黑點(diǎn)在動(dòng)，小黑點(diǎn)有時(shí)呈點(diǎn)狀，有時(shí)呈小的片狀，運(yùn)動(dòng)形式為在原地振動(dòng)（類似布朗運(yùn)動(dòng)），這種小黑點(diǎn)既不是細(xì)菌、霉菌，也不是支原體， 目前業(yè)內(nèi)人士稱

10、其為“黑膠蟲”。（2）黑膠蟲一般是存在血清里的，它會(huì)不斷增多，達(dá)到一定數(shù)量時(shí)會(huì)與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)，從而使得細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。（3）可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液不渾濁。黑膠蟲”可寄生于動(dòng)物細(xì)胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細(xì)胞和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)為生，并隨細(xì)胞傳代而傳代，是一種異養(yǎng)生物。（4）鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。6、污染的預(yù)防預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。一般預(yù)防可從以下幾方面著手:（1）從實(shí)驗(yàn)室、物品、用品消毒滅菌著手;（2）從操作者做起，操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操 作技術(shù)要熟練;（3）防止細(xì)胞交叉污染;（4）所有細(xì)胞一旦購置或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之，重新復(fù)蘇培養(yǎng)。7、污染的清除抗生素處理：預(yù)防和殺滅細(xì)菌的