第七章蛋白質(zhì)(或多肽)的放射性標記及分析方法

1、第二部分第二部分 核素示蹤技術(shù)在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用核素示蹤技術(shù)在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 分子生物學(xué)是一門新興邊緣學(xué)科，它跨越了遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、有機與無機化學(xué)、生物化學(xué)、物理學(xué)、生物物理學(xué)等許多學(xué)科，是當代數(shù)、理、化科學(xué)廣泛深刻地滲入生物學(xué)而形成發(fā)展起來的。其中，核素示蹤技術(shù)在其中起著里程碑性的重要作用。一、一、35S和和32P雙標記噬菌體感染實驗證明雙標記噬菌體感染實驗證明DNA是遺傳信息的載體是遺傳信息的載體1952年，Hershey和Chase用大腸桿菌的T2噬菌體繁殖實驗，證實了從噬菌體顆粒注入到細菌中去的DNA含有繁殖后代噬菌體所需的全部信息。T2噬菌體顆粒由蛋白質(zhì)外殼包裹的D

2、NA(單鏈)核所組成。在DNA核與蛋白質(zhì)外殼中，只有DNA含有磷原子，只有蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫原子，把T2噬菌體放在以放射性磷(32PO43)為唯一磷源和以放射性硫(35SO42)為唯一硫源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，即可獲得32P標記的DNA和35S標記的蛋白質(zhì)的噬菌體。用這種雙標記的噬菌體去感染大腸桿菌寄主，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有32P標記的DNA注入到寄主細胞內(nèi)部并繁殖出具有蛋白外殼的子代噬菌體。在這些子代噬菌體中，有少量的DNA帶有標記32P，但沒有一個蛋白外殼帶有標記35S。證實了DNA是遺傳信息的攜帶者。二、二、1515N,N,1414N N標記標記E.ColiE.Coli繁殖實驗證明雙

3、鏈繁殖實驗證明雙鏈DNADNA具有半保留的復(fù)制機制具有半保留的復(fù)制機制 1957年，Meselson-Stahl用放射性標記技術(shù)，實驗證明了Watson與Crick提出的雙鏈DNA半保留復(fù)制理論。在半保留復(fù)制中，親本雙鏈DNA的兩條鏈分開，它們根據(jù)堿基配對原則各自以自己為模板，選取適當?shù)膲A基組成兩條子代雙鏈，完成復(fù)制過程。實驗是這樣進行的：先使細菌培養(yǎng)物(EColi)在以15N標記的15NH4C1為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長許多代，使DNA分子都標記上重同位素15N。再把細胞轉(zhuǎn)移到含普通同位素15N的培養(yǎng)基上。在轉(zhuǎn)移后不同時間收集細胞樣品，提取DNA并作CsCl密度梯度離心。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有密度介于重的

4、15N，14N和輕的15N，14N DNA之間的雜化分子15N，14N DNA出現(xiàn)。這種雜化分子隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸增多。當培養(yǎng)到ECo1i繁殖第一代的時間時，雜化分子成為主要成分。爾后即有輕的15N，14N DNA分子出現(xiàn)。當培養(yǎng)到EColi第二代時，雜化DNA與輕DNA各占一半。取雜化DNA分子在100下作熱變性處理后于CsCl中離心，可以出現(xiàn)兩條區(qū)帶，它們分別為14N單鏈DNA和15N單鏈DNA。Meselson-Stahl實驗證實了E.Coli繁殖中，親代DNA分為兩條單鏈，各自成為子代雙鏈DNA的模板，雙鏈DNA具有半保留復(fù)制機制。 三、三、3232P P標記分子雜交實驗證明遺傳信

5、息從標記分子雜交實驗證明遺傳信息從DNADNA到到mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄 Spiegelman利用人工合成RNA-DNA雜種分子的實驗證明RNA分子的核苷酸順序由DNA轉(zhuǎn)錄決定，RNA分子的生物信息來自DNA。把雙鏈DNA加熱，使產(chǎn)生單鏈DNA分子，若在熱溶液逐漸冷卻過程中加入與該DNA鏈互補的單鏈mRNA，則在形成復(fù)性DNA分子的同時會有DNA-RNA雜種分子形成。形成雜種分子的條件是這種RNA分子的核苷酸順序與DNA分子中某些核苷酸順序互補。利用這個原理，可以鑒別RNA與DNA堿基順序是否有互補的特性。實驗也可采用放射性標記技術(shù)進行。將T4噬菌體感染的大腸桿菌(EColi)放在含32

6、PO43的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取32P標記的RNA，將32P-RNA分別加到EColi的DNA熱溶液和T4噬菌體的DNA熱溶液中，溶液慢慢冷卻后上膜過濾，除去游離RNA，測量膜上物質(zhì)的32P放射性活度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加到T4 DNA溶液中的32P-RNA大部分已和T4 DNA形成雜交分子并留在膜上，而加到EColi DNA溶液中的32P-RNA很少與EColi DNA形成雜交分子因此很少留在膜上。這個實驗證明了感染后合成的RNA和噬菌體DNA的堿基順序互補，前者的堿基順序由后者決定，同時感染后合成的RNA并下與宿主細胞DNA互補。這個結(jié)果和關(guān)于噬菌體DNA是合成噬菌體mRNA的模板這一早期推測完全一致。

7、 四、四、3 3H-H-亮氨酸標記網(wǎng)織紅血球培養(yǎng)實驗證明多肽鏈合成起始于亮氨酸標記網(wǎng)織紅血球培養(yǎng)實驗證明多肽鏈合成起始于氨基末端氨基末端 多肽鏈是從氨基末端還是從羧基末端開始延伸的，Dintzis的放射性標記實驗作出了回答。把網(wǎng)織紅血球加3H標記的亮氨酸3H-Leu作體外培養(yǎng)，蛋白質(zhì)合成后分離提取出新合成的血紅蛋白，分析該蛋白肽鏈中的放射性分布。實際上，如果培養(yǎng)的時間相對較長時(如3min)，那么在合成的肽鏈中，有一些是在加入3H-Leu前已接近完全合成的，這些肽鏈中只在遠離生長點的地方有3H-Leu；另一些肽鏈是在加入3H-Leu后才開始合成的，這些肽鏈幾乎整條鏈上都分布有3H-Leu還有更

8、多的肽鏈一段在3H-Leu加入前另一段在3H-Leu加入后合成，且長短不一。這樣，血紅蛋白鏈有如圖7-2所示的3H-Leu分布。如果培養(yǎng)的時間很短(如30s)，則只有在3H-Leu加入前已經(jīng)合成了某一片段的那些鏈，才有可能完成整個鏈的合成。故靠近某一端的3H-Leu放射性比另一端強許多(圖7-2 H p448)且有一定的梯度分布。實驗表明，血紅蛋白肽鏈中靠近氨基末端的放射性比活度最低，靠近羧基末端的則最高，從而證明肽鏈的合成是由氨基端到羧基端的方向延伸的。 五、五、1414C C標記氨酰基標記氨?；鵷RNAtRNA對三聯(lián)體遺傳密碼的研究對三聯(lián)體遺傳密碼的研究 蛋白質(zhì)是一類按一定順序排列起來的氨

9、基酸所組成的多肽結(jié)構(gòu)，它的生物合成過程是mRNA密碼信息經(jīng)核糖體解譯的轉(zhuǎn)譯過程。放射性標記實驗技術(shù)在了解這個遺傳密碼的解讀上也有重要作用。實驗原理如下：由A，U，G，C四種核糖核苷酸中的三種人工合成某一種三核苷酸，取20種氨酰基-tRNA中的一種用14C或3H標記，使該三核苷酸與19種非標記及1種標記的氨?；?tRNA以及適當?shù)暮颂求w組成一個反應(yīng)系統(tǒng)。三核苷酸代表mRNA上的一個三聯(lián)體密碼，使相應(yīng)的氨酰基tRNA結(jié)合到核糖體上。反應(yīng)結(jié)束后看哪一種標記的氨?；?tRNA可被結(jié)合，定出該三核苷酸密碼與哪一種標記的氨?；?tRNA有對應(yīng)的結(jié)合關(guān)系，從而可以確定mRNA上三聯(lián)體密碼子在轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)中的

10、意義。 本部分主要內(nèi)容：本部分主要內(nèi)容：第七章第七章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(或多肽或多肽)的放射性標記及分析方法；的放射性標記及分析方法；第八章第八章 同位素示蹤技術(shù)在同位素示蹤技術(shù)在DNADNA序列測定中的應(yīng)用序列測定中的應(yīng)用 ；第九章第九章 放射性核酸探針的制備及其應(yīng)用。放射性核酸探針的制備及其應(yīng)用。第七章第七章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(或多肽或多肽)的放射性標記及分析方法的放射性標記及分析方法 一、蛋白質(zhì)（或多肽）的放射性標記方法一、蛋白質(zhì)（或多肽）的放射性標記方法 在現(xiàn)代生物和醫(yī)學(xué)的研究和應(yīng)用中，需要將胰島素胰島素等具有生物活性的蛋白質(zhì)（或多肽）進行特異性的標記，以研究它們在生物體內(nèi)或離體狀態(tài)下的生理生

11、化特性及功能與作用機制等。 目前主要的標記類型有： 放射性標記 酶標記 熒光標記 化學(xué)發(fā)光標記。 蛋白質(zhì)（或多肽）的放射性標記，目前主要有： 化學(xué)標記法 生物合成標記法 1、化學(xué)標記法、化學(xué)標記法 （1）125I標記標記 125I的半衰期為60天，衰變方式為電子俘獲（EC），能量為35 kev。為了敘述方便將方法具體化，我們主要以胰島素的125I標記為例。 胰島素分子是有A，B兩條多肽鏈組成的，分子中共用4個酪氨酸殘基，即A14、 A19、 B16和B26酪氨酸。在沒有-SH存在的氧化條件下，125I可置換酪氨酸殘基苯環(huán)上羥基鄰位的氫原子，使之碘化為單碘或雙碘酪氨酸。 因胰島素分子中4個Tyr

12、都可以發(fā)生此反應(yīng)，使A14、A19、B16和B26中被碘化的Tyr不只一個。但研究表明，單碘胰島素比雙碘胰島素具有更高的免疫活性。 生物學(xué)家、放免學(xué)家、醫(yī)學(xué)家和實驗內(nèi)分泌學(xué)家在制備單碘胰島素上作了各種方法學(xué)的探索。由于碘化方法不同，對胰島素的碘化情況也不盡相同。 A14A19B16B26 氯胺氯胺T T碘化法（碘化法（CTCT法）法） A A、原理、原理 放射性碘可參與到蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上，形成單碘或雙碘Tyr。Na125I的碘是負離子（I-），只有正碘離子（I）才能取代Tyr苯環(huán)上與羥基鄰位（3位或5位）的質(zhì)子。因此，反應(yīng)需加氧化劑。 氯胺氯胺T T（學(xué)名：氯胺趕對甲苯磺酸鈉）就是一種催化劑

13、，它可從負碘離子上移去一對電子，使之轉(zhuǎn)變成正離子（I-I）或125I碘化反應(yīng)幾乎在瞬間完成。標記的蛋白質(zhì)用凝膠過濾等方法提純。 反應(yīng)式如下：B B、操作方法、操作方法 取胰島素液10 l（5 l），0.4 mol/L，pH 7.4磷酸緩沖液50 l，Na125I液7.4107 Bq氯胺T液10 l(100 g)?；靹蚍磻?yīng)1-3 min。加入偏亞硫酸鈉(Na2S2O4)液100 l（250 g）（還原過剩的氯胺T），終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物一般用Sphadex G25或其他柱層析法脫鹽得到的標記物是4種單碘胰島素和雙碘胰島素的混合物。分離方法各種碘標胰島素（將在下面介紹）。Freychet和Lind

14、e等人以大鼠脂細胞來測定氯胺T法標記的胰島素的生物活性，發(fā)現(xiàn)僅為天然胰島素的60-70%。 C C、優(yōu)缺點、優(yōu)缺點 優(yōu)點：優(yōu)點： 簡單、快速。 缺點：缺點： 由于終止反應(yīng)時，所用的還原劑偏亞硫酸納的濃度太高，對蛋白質(zhì)中的二硫鍵會產(chǎn)生還原作用； 標記時，雖然蛋白質(zhì)分子暴露于氯胺T下的時間很短，但蛋白質(zhì)分子還是可被氧化脫羧和脫氨。 因此，這種碘化反應(yīng)難以控制，會出現(xiàn)較多的雙Tyr取代蛋白質(zhì)或雙碘蛋白質(zhì)，以及較多的損傷蛋白質(zhì)，而使產(chǎn)物的免疫活性及生物活性都達不到受體分析的要求。同時，還原劑可能殘留于標記物中，使其保存（有效）期較短，一般只有11.5個月。 酶促碘化法酶促碘化法 70年代人們開始用酶標

15、記法，此法可避免氧化劑與蛋白質(zhì)分子直接接觸。 基本原理：將氧化型的125I-結(jié)合于酶分子上，形成“酶125I”復(fù)合物，然后在酶的催化作用下，將125I轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的Tyr殘基上。酶標法得到的產(chǎn)物，標記損傷可大大減少，反應(yīng)條件也較易控制。主要有三種： A A、辣根過氧化物酶碘化法（、辣根過氧化物酶碘化法（HorseperoxidaseHorseperoxidase，HPOHPO法）法） 辣根過氧化物酶能與125I形成酶碘化合物，H2O2由葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產(chǎn)生，當I/胰島素的比值為1.0時，標記產(chǎn)物中單碘胰島素約占99%。其中A19占98%，A14、B16和B26單碘化合物均小于1%。比活度

16、可達4.4106 Bp/ug左右。幾乎只產(chǎn)生一種單碘化合物，即A19單碘胰島素，是HPO法的優(yōu)點。已知A19-Tyr在胰島素單體上位于表面一個不變的區(qū)域。這個區(qū)域被認為是胰島素受體結(jié)合的區(qū)域。這可以解釋HPO法所得到標記化合物以A19單125I-胰島素為主的現(xiàn)象。但隨著I/胰島素比值的增加，A14、B16和B26單碘標記率也隨之增加；此外，B16和B26殘基位于同一表面區(qū)域，在HPO法中，B16和B26單碘化合物卻很低。此說明，HPO將125I轉(zhuǎn)移到Tyr殘基上的過程，除了接觸Tyr的難易程度和空間位置外，還包括酶促作用的選擇性。詳細機理至今不甚明了（涉及到蛋白質(zhì)構(gòu)象問題）。 B B、乳過氧化

17、物酶碘化法（、乳過氧化物酶碘化法（LactoperoxidaseLactoperoxidase，LPOLPO法）法） 1971年Ferychet等人首先采用此法，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離標記混合物，得到了A14和A19兩種單碘胰島素。標記方法如下：取Na125I 37107/1030 l、磷酸緩沖液（PBS）（0.250.5 mol/L，PH 7.4-7.6）10 l、胰島素10 g/10 l、H2O2 50 g/10 l、LPO 1 g/5 l混合，反應(yīng)5 min，加40 %蔗糖4050 l混合，上凝膠柱電泳。在中性條件下，乳過氧化物酶可與125I形成“酶-125I”復(fù)合物，然后將125I

18、轉(zhuǎn)移到Tyr殘基上。此法與HPO法相似，但不同的是，LPO法所得到的單碘胰島素中，A14含量較高，可占所得單碘胰島素的3570%；A19標記物比HPO法少。A鏈單碘胰島素占全部標記物的9899%，B鏈單碘標記物僅占12%。LPO法較簡便，省時，得到的A14單碘標記物較多，宜作受體分析。 C C、LPO-LPO-葡萄糖氧化酶碘化法（葡萄糖氧化酶碘化法（Lactoperoxidase-Glucose Lactoperoxidase-Glucose OxidaseOxidase：LPO-GOLPO-GO） 由于在LPO碘化法中，H2O2是直接加入的，因此對蛋白質(zhì)（或多肽）的損傷較大。 1977年，T

19、ower等人用葡萄糖氧化酶在溶液中催化氧和-D-葡萄糖，使之連續(xù)不斷的產(chǎn)生少量的H2O2。這比直接加入H2O2易于控制，避免H2O2太多和局部濃度太大對蛋白質(zhì)或多肽分子中二硫鍵和色氨酸，胱氨酸等的損傷太大，從而減少標記損傷，使125I化的蛋白質(zhì)或多肽能保持良好的生物或免疫活性。 聯(lián)結(jié)碘化法聯(lián)結(jié)碘化法 這是近年來常用的蛋白質(zhì)碘化法。它是通過末端氨基與碘化試劑形成肽鍵而完成蛋白質(zhì)的標記。 碘化試劑有：碘苯胺、甲基-對-羥基苯亞胺脂、碘化對氨基苯磺酸、二磺熒光素和Bolton-Hunter試劑（學(xué)名：3-（4-羥基苯）-丙酸琥珀酰亞胺脂）。 其中以Bolton-Hunter試劑用的最為廣泛，它是N-

20、羥基丁二酰和碘化對羥基丙酸形成的脂，可在實驗室從N-琥珀酰3-（4-羥基苯）-丙酸鹽合成。 須注意：Bolton-Hunter試劑在水中很容易失活，酶促法顯著減弱其活性，而Bolton-Hunter試劑對活性毫無影響。 固相碘化法固相碘化法 IODOGEN是近年來發(fā)展起來的一種固相125I化標記試劑。名稱1,3,4,6-四氯-32,62-二苯基甘（代）聯(lián)脲（1,3,4,6-Tetrachloro-32,62-diphenlglycouril）。1978年Fraker和Speck首次介紹用IODOGEN對蛋白質(zhì)和細胞膜進行125I標記。IODOGEN不溶于水，故可以固相形式參與蛋白質(zhì)的碘化過程。

21、以后相繼報導(dǎo)用IODOGEN碘化標記大腸桿菌核糖體蛋白質(zhì)、家兔網(wǎng)織細胞核糖體蛋白質(zhì)、仙臺病毒、人生長激素和促甲狀腺素、人細胞和組織培養(yǎng)的細胞、大鼠纖維蛋白質(zhì)和人纖維蛋白質(zhì)等。下面介紹利用IODOGEN 125I標記方法標記經(jīng)去污劑Sarkosyl NL-97裂解的甲型流感病毒的基本過程。A A、IODOGENIODOGEN固相的制備固相的制備 IODOGEN 1 mg溶于1 ml氯仿中，取10 l加入1275 mm玻璃試管中，室溫下在通風(fēng)櫥內(nèi)用氮氣氣流將溶劑揮發(fā)，待徹底干燥后即可用于標記。B B、流感病毒的裂解、流感病毒的裂解 純化的甲型流感病毒X-31（H3N2）50 g，懸浮于100 ml

22、 STE（PH 8.0）中，加入25 l 10 % Sarkosyl NL-97，37溫育15 min。 C C、碘化反應(yīng)、碘化反應(yīng) 用STE（0.15M氯化鈉、10 mM Tris、1 mM EDTA、PH 8.0）充分洗滌。已制備好的IODOGEN固相反應(yīng)器，以除去管壁上附著不牢固的IODOGEN。將已裂解的病毒懸浮液加入管內(nèi)，隨即加入125I-NaI 0.5 mCi（110 mCi/ml），室溫下反應(yīng)30 min，間或輕輕震蕩試管，以增加病毒和125I-NaI與固相IODOGEN的接觸機會。吸出管內(nèi)全部液體，則反應(yīng)自行終止。以葡聚糖凝膠G-50柱層析除去未標記游離碘。標記病毒的放射性可達

23、310 mCi/mg蛋白。D D、對、對IODOGENIODOGEN碘化法的評價碘化法的評價 此法非常簡便有效。碘化反應(yīng)可在037下進行，反應(yīng)不受去污劑、變性條件或酶抑制劑的影響。樣品從反應(yīng)管取出后反應(yīng)即終止。樣品可直接進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。因此非常適合于蛋白質(zhì)體標記。IODOGEN固相管一次可制多個，并能在室溫下長期保存。在SDS或Sarkosyl NL-97等變性劑存在下，IODOGEN能有效的標記各種蛋白質(zhì)或多肽，所獲得的放射性活度一般高于氯胺T法。 （2 2）3 3H H和和1414C C標記標記 甲基化反應(yīng)和烷基化反應(yīng)甲基化反應(yīng)和烷基化反應(yīng) 蛋白質(zhì)的賴氨酸（或末端）氨基可與

24、甲醛和硼氫化物發(fā)生還原甲基化反應(yīng)：Pro-NH2+2 HCHO+1/2 NaBH4 Pro-N(CH3)2+1/2 Na H2BO3+1/2 H2O因此，用3H或14C-甲醛或3H-硼氫物可標記蛋白質(zhì)。按每個氨基加上兩個甲基計算，用14C-甲醛可得比放射性為5106 dpm/mg的標記蛋白質(zhì)，相當于最大理論值的20 %。用3H-硼氫物標記蛋白質(zhì)，其比放射性可達3.5108 dpm/mg蛋白質(zhì)，比氯胺T碘化法高。NaHB4在水溶液中易分解，這種分解在堿性PH值較慢，在室溫pH 9時，其T1/2也只有10 min；在pH 8則僅1 min左右。氰基硼氫化鈉在水溶液中穩(wěn)定，用它代替NaHB4，反應(yīng)可

25、在pH 7條件下進行，這有利于某些不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的標記。此外，在蛋白質(zhì)的多種殘基，如半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈上，很容易引入羥甲基。d-鹵酸鹽，如碘乙酸鈉或溴乙酸鈉是常用的烷化試劑。利用3H或14C烷化試劑可標記蛋白質(zhì)。 3 3H H和和1 1H H的交換反應(yīng)的交換反應(yīng)溶劑中的3H可與肽鍵和一級胺上的1H交換。利用這個反應(yīng)可將3H標記在蛋白質(zhì)上。交換法簡便，反應(yīng)條件溫和，不損傷蛋白質(zhì)活性。但因交換法反應(yīng)是可逆的，標記原子可迅速回到溶液中9比如2小時內(nèi)可減少到25 %）。因此，用這種方法標記的樣品應(yīng)及時進行分析和測定。 （3 3）金屬蛋白（）金屬蛋白（MetalloproteinsMe

26、talloproteins）中金屬原子的標記）中金屬原子的標記生物體內(nèi)有一些含金屬原子的蛋白質(zhì)（酶），它們在生物體內(nèi)起著非常重要的作用。如固氮酶的兩個組分中，F(xiàn)e蛋白是一種Fe-S蛋白，MoFe蛋白是由兩種不同的亞單位組成的四聚體，并含兩個絡(luò)合和還原底物的Fe MoCo與兩個可能起傳遞和貯存電子作用的、由雙Fe4S4組成的P-cluster。因此MoFe蛋白是含金屬Mo、Fe的酶。自然界中還存在分別以V和Fe取代Mo（第一固氮酶體系）的第二、第三固氮酶體系。這些事實表明可固氮酶在所含金屬種類方面具有生物多樣性。目前，許多金屬原子和生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系還不很清楚。同位素示蹤技術(shù)是進行此項

27、研究的重要手段之一。下面我們主要以99Mo標記Mo Fe蛋白為例，進行這方面的探討。其化學(xué)標記主要有拆卸與組裝法。先將蛋白質(zhì)中的金屬部分在某種條件下拆卸下來，使之與多肽鏈分離，再用帶放射性的重組液與這種多肽鏈在一定條件下重組，將金屬部分進行重心組裝而后標記。例如，用鄰菲啰啉和氧或尿素可將Mo Fe蛋白中的P-cluster和Fe Mo Co部分或全部拆卸下來而得到不全蛋白（apo-protein），再用含99Mo、Fe、S的重組液與apo-protein重新組裝金屬原子簇，從而使重組的Mo Fe蛋白帶上99Mo的標記。 *棕色固氮菌棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii)

28、野生型固氮菌野生型固氮菌含鉬固氮酶的基本結(jié)構(gòu)含鉬固氮酶的基本結(jié)構(gòu) 固氮酶是一種由兩種組分蛋白組成的金屬酶。棕色固氮菌含鉬固氮酶由鐵鐵（Fe）蛋白（蛋白（Av2）和鉬鐵鉬鐵（MoFe）蛋白（蛋白（Av1）。 Av2 Av1= subunit; ,=,subunit, respectively = subunit; ,=,subunit, respectively Fe4S4=4Fe cluster M=FeMoco; P=P-cluster 電子的傳遞路線為電子的傳遞路線為：Av2伴隨伴隨MgATP水解，通水解，通過其過其4Fe-4S簇將電子傳至簇將電子傳至Av1的的P-cluster, 然后至

29、底然后至底物還原中心物還原中心FeMoco。 Av2為兩個相同亞單位組成的2聚體，含個4Fe-4S簇。Av1則為兩種亞單位組成的聚體，分子量位220240KD，含一對FeMoco Mo1Fe7S9.homocitrate和兩個P-cluster Fe8S7。FeMoco(鐵鉬輔因子鐵鉬輔因子)P-cluster(兩種氧還狀態(tài)兩種氧還狀態(tài))金屬硫蛋白（Metallothprtein，MT）是一種分子量較小，半胱氨酸含量高，熱穩(wěn)定且與金屬離子有較高親和力的蛋白質(zhì)。MT在調(diào)節(jié)動物體內(nèi)微量元素的代謝以及重金屬離子的貯存與解毒等方面具有重要的生理意義。對于金屬硫蛋白還可以用放射性銀（110mAg）通過置

30、換反應(yīng)進行標記，從而測定其含量。 2 2、生物合成標記法、生物合成標記法化學(xué)標記法是標記已合成的蛋白質(zhì)，而生物合成標記法則是在蛋白質(zhì)合成過程中引入標記原子。主要有體內(nèi)和體外兩種標記方法。（1 1）體內(nèi)標記法（）體內(nèi)標記法（in vivoin vivo） 給機體一個合適的放射性前體（主要為氨基酸）或標記化合物，通過體內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成將標記原子引入。前體或標記化合物給予的方式對于動物有口服、腹腔、皮下、肌肉或靜脈注射，而對植物和微生物則采用噴施或加到培養(yǎng)液中引入。常用的同位素有3H、14C、35S以及金屬原子（如99Mo等）。前體多采用亮氨酸和賴氨酸，因為它們在多數(shù)蛋白質(zhì)中含量較高，并且在代謝過程

31、中不會轉(zhuǎn)變成其他氨基酸。蛋氨酸在蛋白質(zhì)中含量雖然不高，但由于它們可用35標記，比放射性較3H標記的氨基酸高且比較便宜，故也常用于生物合成標記。標記前體或化合物的引入量和時程，隨使用的生物、標記前提或化合物的放射性強度、代謝通路及問題的性質(zhì)而定。經(jīng)常可根據(jù)經(jīng)驗或通過預(yù)實驗確定方案。例如對固氮菌中Mo Fe蛋白的99Mo標記，只要在培養(yǎng)液中加入1M（99Mo活性為1 mCi）的Na299 MoO4可得到活性約10Ci的樣品。 體內(nèi)標記法的特點：標記蛋白質(zhì)的性質(zhì)不會有任何改變，能同時標記多個器官或多種組織的蛋白質(zhì)。在研究整體代謝方面，體內(nèi)標記是不可缺少的。但它的應(yīng)用有其局限性，這是因為： 標記前體或

32、化合物通過道謝通路參加蛋白質(zhì)，由于代謝庫的稀釋作用，供細胞合成蛋白質(zhì)所用的標記前體或化合物的比放射性降低，并且難以測定； 代謝庫本身有隨代謝速率而變，故難以估計； 放射性物質(zhì)用量大，既造成浪費又易造成污染。（2 2）體外標記法（）體外標記法（in vitroin vitro）體外標記法主要是借助細胞培養(yǎng)技術(shù)，把標記前體或化合物加入到培養(yǎng)液中，細胞通過生物合成而完成標記的方式。一般多用氨基酸或有機離子作為標記物，故他們很容易穿古過細胞膜。與體內(nèi)標記相比，體外標記的最大優(yōu)點是可以精確控制溫度、pH、離子強度等環(huán)境因素。同時，可對不同組織或器官以及不同生長時期的細胞進行標記。 二、標記蛋白二、標記蛋

33、白(多肽多肽)的分離技術(shù)的分離技術(shù)不論采用前述中的任何標記方法，得到的產(chǎn)物均是各種物質(zhì)的混合物，因此需要進行分離和純化。根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量，電荷等物理性質(zhì)及狀態(tài)的不同，可采用吸附與分配層析、離子交換層析、凝膠層析、素和層析、電泳、超速離心、色譜等技術(shù)進行分離。下面著重介紹以125I標記胰島素時，所得各種混合物的分離技術(shù)。用125I標記胰島素時，混合物主要包括： 1、未標記胰島素； 2、四種單碘標記胰島素； 3、雙碘及雙取代胰島素； 4、損傷而未被標記的胰島素； 5、損傷的標記胰島素； 6、游離的無機鹽離子，如125I-； 7、其他（如氧化劑或酶及其降解產(chǎn)物等）。分離純化常用的方法主要有：1

34、 1、分子篩法、分子篩法 單碘胰島素分子中的Tyr酚環(huán)羥基鄰位上的氫原子被一個碘原子置換后，酚羥基的pK值從10.1下降到8.6，被兩個碘原子置換，pK值降至6.8。在pH 8.6時，原型胰島素所帶的凈電荷為單碘胰島素的一半，pH為6.8 時，則差別更大。根據(jù)在相同pH時，碘化胰島素所帶靜電荷不同于原型胰島素的原理，有人用離子交換層析，或聚丙烯酰胺凝膠電泳法將標記胰島素和未標記胰島素分開。2 2、離子交換法、離子交換法 用DEAE-Sephadex A25，AE纖維素，Amberlite IRA-400陰離子交換樹脂，采用梯度洗脫或改變洗脫液離子強度或pH等方法，可將未標記胰島素、標記胰島素（

35、包括單碘、雙碘胰島素）、雙取代或雙碘胰島素逐一洗脫下來。但是此法并不能分離碘化位置不同的單碘胰島素。3、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 此法首先于1959年由Omstein和Darris報道。由于其操作簡便，儀器簡單，分辨率高，而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究。1974年被用于碘化胰島素的分離，此后不斷得到改進。此法能將標記胰島素與未標記胰島素，損傷碎片及游離125I-等無機鹽分開，還可將單碘A14和A19，雙碘胰島素等分開。聚丙烯酰胺是由95%的丙烯酰胺和5%雙甲叉丙烯酰胺經(jīng)過硫酸銨活化聚合而成。電泳過程中，由于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)的差別，Rf值不同，使標記混合物中各種成分

36、能得到分離，A14和A19單碘胰島素雖然都標記一個125I-，但亦能被分開；確切機理尚不清楚。B16和B26單碘胰島素與A19標記物Rf值相同，不能分開。無機鹽（包括125I-），在此系統(tǒng)中泳動最快，在指示染料帶之前，能滿意除去。由此得到的A14和A19單碘胰島素質(zhì)架期可達6個月。其他如等電聚焦法亦可獲得較純的A14和A19單碘標記物，但方法較復(fù)雜，儀器和試劑要求教高，不盡實用。 4 4、聚丙烯酰胺凝膠電泳加、聚丙烯酰胺凝膠電泳加QAEQAE陰離子交換層析陰離子交換層析 單獨采用以上任意一種方法，多不能達到將B16和B26單碘標記物分離出來的目的。國外近年采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加QAE陰離子交

37、換層析的方法，得到四種單碘胰島素（圖78）。5 5、反向高效液相層析（、反向高效液相層析（RP-HPLCRP-HPLC） 近年來，采用反向高效液相層析（RP-HPLC）制備柱分離胰島素標記物已有報道，發(fā)現(xiàn)有較大優(yōu)點。如：省時、效率高、成本低、分離完全、能得到高比放射性高生物活性的四種單碘胰島素（圖79、10）。三、標記蛋白三、標記蛋白( (多肽多肽) )的分析方法的分析方法由于在“一”中，利用各種標記方法所得的標記蛋白質(zhì)均非單一，而是多種蛋白的混合物。為了探明某種特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，一方面要建立分離方法，另一方面要建立有效的分析手段。1 1、抗原、抗原抗體放射性免疫分析抗體放射性免疫分析

38、這種分析方法是利用抗原和抗體反應(yīng)的特異性，在蛋白質(zhì)混合物中加入特異的抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物，從而檢測和定量蛋白質(zhì)混合物中的目的抗原。通過與蛋白質(zhì)放射性標記及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合，這種分析方法可檢測出低至100 pg的放射性標記蛋白。 2 2、凝膠電泳和放射自顯影分析、凝膠電泳和放射自顯影分析標記蛋白質(zhì)電泳譜的分析，大致可分為放射性計數(shù)和放射照相兩法。前者指用放射性探測器直接定量測定凝膠中的放射性強度；放射照相乃通過射線或間接通過光子的作用使膠片感光成像，然后用顯微密度計定量測量。（1 1）放射性計數(shù)法）放射性計數(shù)法 分段計數(shù)分段計數(shù) 常用的方法是電泳后將乳膠切成小片，分段計數(shù)。

39、此法須注意兩個問題：A、不要等厚度隨機切片，應(yīng)先染色，選擇性切下斑點，以免造成兩個寬度相當、強度相等的峰的計數(shù)率很不相同；B、因凝膠切片有一定厚度，樣品包埋其中，閃爍體滲入能力有限，因而相當部分的放射性不能回收。使凝膠完全溶解，把樣品從凝膠中洗脫出來，或?qū)㈤W爍體摻和到凝膠中去，可以解決分段計數(shù)放射性回收問題。聚丙烯酰胺凝膠可溶于30%H2O2，每片凝膠（厚0.51cm）加1 ml 30%H2O2，60保溫至完全溶解，再加合適的閃爍液計數(shù)。如果先加0.2 ml 60%過氯酸，再加0.4ml 30% H2O2，則凝膠更易溶解。瓊脂糖凝膠在1N HCl，90下很易溶解。凝膠在含6 M尿素的1% SD

40、S溶液中，37，保溫40小時，蛋白質(zhì)可被洗脫出來。其缺點是洗脫不完全，且不確定，放射性稀釋也無法避免。閃爍體可摻和到凝膠中（方法見下文）。摻有閃爍體的凝膠片直接放在計數(shù)杯中，無需加閃爍液即可計數(shù)。 整膠掃描整膠掃描 薄層層析和紙電泳后，分離圖譜上放射性計數(shù)管廣泛采用鐘罩或計數(shù)管掃描，但后來為高靈敏液體閃爍計數(shù)技術(shù)取代?，F(xiàn)在，通過改良掃描裝置，提高鐘罩流氣或計數(shù)器的靈敏度，放射性掃描的靈敏度已與液體閃爍計數(shù)法相當，足以對聚丙烯酰胺膠板進行定量探測。西德 Berthold公司生產(chǎn)的線形分析器，可通過鐘罩式計數(shù)管的移動（移動速度取決于放射性強度）逐行掃描整塊凝膠。它不僅可以象普通流氣式計數(shù)器那樣計數(shù)

41、放射性脈沖，還可以定出脈沖發(fā)射點在陽極絲上的出現(xiàn)和到達末端的傳播時間完成的。每行同時處于線形分析器計數(shù)管的開放式入射窗（約251.5 cm）下，記錄脈沖的陽極絲與入射窗長軸平行。同時記錄位于該行上所有放射性的位置。這種線形分析器20 min可記錄只有250 dpm 3H或50dpm 14C的放射性斑點。此掃描儀配有專有計算機，可輸入整塊凝膠的測量程序（掃描行距等），并能做數(shù)據(jù)處理，包括對各行的比較。這種掃描裝置具有操作簡便，靈敏度高，分辨力好的優(yōu)點。 （2 2）放射照相法）放射照相法 直接放射自顯影直接放射自顯影 電泳凝膠板與感光膠片（X線膠片）直接接觸，凝膠中的放射性標記蛋白質(zhì)發(fā)生的射線使膠

42、片溴化銀活化成銀離子。直接放射自顯影適用于檢測發(fā)射高能粒子或X射線的同位素，例如14C、35S、32P和125I，而且只有當樣品中的放射性強度足以形成有效潛影時，才能采用。高能粒子的放射自顯影可以直接在凝膠上進行，若為14C則宜先將凝膠干燥，以減少自吸收。凝膠厚度不要超過0.4 mm，否則底層的粒子不能到達X線膠片。32P曝光數(shù)小時即可，14C須幾天或幾周。短時間曝光可在室溫下進行，長時間曝光則應(yīng)在-70完成，以減少樣品擴散。干燥凝膠勿須低溫曝光。直接放射自顯影的靈敏度較高，曝光24小時能檢測到6000 dpm的4C或35S，575 dpm的32P，1600 dpm的125I斑點。 間接放射自

43、顯影間接放射自顯影 32P和 125I發(fā)射的高能粒子或X射線，不僅可直接使X線膠片感光，也能穿過膠片。若在膠片后面放置增感屏，這些穿透膠片的射線在熒光屏上可產(chǎn)生光子，光子也能使膠片感光，于是使原來的信號增強，此即所謂間接放射自顯影。為到達最佳效果，膠片需預(yù)閃并且在-70曝光。膠片預(yù)閃指在曝光前使膠片預(yù)曝光。預(yù)閃可以普通電子閃光燈做光源，曝光距離為70100 cm，曝光時間須小于1 mS。預(yù)閃膠片不宜保存，應(yīng)臨用前預(yù)閃。將預(yù)閃膠片的霧化面（預(yù)閃時對著光源的那一面）貼著增感屏，干燥凝膠放在膠片另一側(cè)，使成為凝膠：膠片：增感屏“三合板”。也可用兩塊增感屏，即增感屏：凝膠：膠片：增感屏“四合板”。外面

44、加玻板后捆扎，或用X線膠片匣夾起來，在-70曝光。由于粒子或射線的軌跡并不總是與凝膠垂直，而且X線膠片位于增感屏與凝膠之間，增感屏的使用可以減低影像分辨能力，不過問題并不嚴重。從表3可以看出，間接放射自顯影的靈敏度比直接放射自顯影有明顯提高。 熒光照相熒光照相（參考重組DNA的原理與方法P-67）放射自顯影不能用于3H和低水平14C、35S的分析。為解決此問題，1974年Bonner和Laskey創(chuàng)造了熒光照相術(shù)。把熒光體引入凝膠，使與標記蛋白質(zhì)直接接觸，粒子通過與臨近的熒光體相互作用將能量轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽?，而使膠片感光成像?；静襟E為：電泳電泳固定固定摻入熒光體摻入熒光體干燥干燥曝光。曝光。現(xiàn)今可

45、選用的熒光體有：PPO、水楊酸鈉、EX3HANCETM 和EXLIGHTXINGTM（后兩種是New England Nuclear產(chǎn)品）四種。其中以二甲基亞砜為溶劑，以PPO為熒光體的配方分辨率最好，其他三種都用使放射性影像變寬的缺點。但摻入PPO需較長時間（約5小時），屬致癌劑。二甲基亞砜又迅速由皮膚吸收，操作時須極小心?？捎帽姿岽娑谆鶃嗧?。摻入水楊酸鈉的靈敏度與PPO相當，但分辨力較差。其優(yōu)點是操作時間較短（1小時），比較安全，且價格便宜。后兩種熒光體比較貴，但靈敏度較高且無毒性，尤其是最后一種產(chǎn)品，其制備僅需15-30分鐘。象間接放射自顯影一樣，熒光照相欲取得最佳效果，須用預(yù)閃膠

46、片在-70曝光。上述三種放射照相技術(shù)，最后是獲得一張分布著濃淡不一斑點的膠片。這膠片的定量分析可在掃描顯微密度計上完成。 3 3、時間微分擾動角關(guān)聯(lián)分析（、時間微分擾動角關(guān)聯(lián)分析（TDPACTDPAC）（1 1）TOPACTOPAC基本理論簡介基本理論簡介 設(shè)原子核從初態(tài)（initial state）i躍遷到中間態(tài)放出一個光子后，又從態(tài)躍遷帶末態(tài)（final state）f放出第二個光子。這兩種光子的分布不是各向同性的，其分布幾率與角有關(guān)（是兩個光子傳播方向的夾角）。即：=().通常稱為角關(guān)聯(lián)函數(shù)。()是可以進行實驗測量的物理量。用探測器D1、D2分別記錄源S放出的兩條射線，再進行符合計算，當

47、固定一探測器（如D1）移動另一探測器（如D2）測量探測器不同夾角時的符合計數(shù)，即可得()，因此()也稱為1、2的符合計數(shù)率（coincidence count-rate）。根據(jù)角動量守恒，初始核自旋速度、最終核自旋速度及產(chǎn)生光子角動量的速度必須符合“三角形法則”，由此推出： ()1+A22Q22P2(cos)+ 其中，A22稱為“各向異性”(anisotropy)系數(shù)，它僅由核能級（unclear level）和衰變特性（decay properties）決定；Q22為固體角關(guān)聯(lián)因子（solid angle correction factor）； P2 (cos)是二階legendre多項式(

48、polynomial)。方程（2）中，象A44 Q44 P4(cos)等高次項由于很小而被省略。在99Mo（T1/2=66 h）衰變成99Tc的過程中，絕對強度較大的-衰變主要有：二級聯(lián)（740-181Kev（分別為12.4%和6.1%）和三級聯(lián)（740-40-141 Kev（分別為12.4%、0.77%和89.9%）。在上述的二級聯(lián)和三級練衰變中，A22Q22分別約為+0.08和-0.10（將A22 Q22用有效值表示，既記為A22eff）。由于中間核（如99Tc）有一定壽命，稱中間核態(tài)壽命（TN），這就意味著i放出1光子躍遷到后，要延遲時間t才放出2光子，再躍遷到f。根據(jù)“符合延遲”測量，

49、TN為t的平均值。這說明()也是時間t的函數(shù)，可測得： (,t)exp(-t/TN)（1+A22eff P2(cos)+）在TN內(nèi)，當中間核態(tài)受到核外電磁場干擾時，其測得的角關(guān)聯(lián)函數(shù)就會發(fā)生變化，即角關(guān)聯(lián)受到擾動，這種現(xiàn)象稱為擾動角關(guān)聯(lián)，并記擾動函數(shù)為G22(t)。這時角關(guān)聯(lián)函數(shù)的表達式應(yīng)為：(,t)exp(-t/TN)（1+A22eff G22(t)P2(cos)+）因此，通過測定(，t)推出G22(t)，就可知道核探針（nuclear probe）周圍的物理和化學(xué)環(huán)境是否發(fā)生變化。對于二級和三級級聯(lián)衰變，通常中間態(tài)的I=5/2，TN=5.19ns。下面我們將討論I=5/2，核四級相互作用（unclear guadrupole interaction，NAC）與時間無關(guān)（漲落可忽略或由于漲落太慢（10-7s）而使核不能跟隨，用統(tǒng)計平均表示，記“static”）和與時間有關(guān)（漲落在10-10s到10-7 s之間，即用馳豫“relaxtion”）。在軸對稱的電場梯度（EFG）張量的影響下，I=5/2態(tài)可劈裂成能量分別為E5/2；E3/2和E1/2