基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略陳娟P(guān)PT課件

1、第一節(jié)第一節(jié) 基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)檢索和比對分析檢索和比對分析第1頁/共77頁就是在數(shù)據(jù)庫中對基因序列或就是在數(shù)據(jù)庫中對基因序列或DNADNA序列進行序列進行 比對分析，以其能夠推測出其結(jié)構(gòu)、功能及在比對分析，以其能夠推測出其結(jié)構(gòu)、功能及在進化上的聯(lián)系進化上的聯(lián)系. .比對方法：比對方法： 1. 1. 雙重比對雙重比對 2. 2. 多序列比對多序列比對直接的數(shù)量關(guān)系直接的數(shù)量關(guān)系進化上曾具有共同祖先進化上曾具有共同祖先基因或基因或DNADNA序列比對序列比對第2頁/共77頁序列比對的結(jié)果：序列比對的結(jié)果：取代取代插入插入缺失缺失Mouse:GGKDSCQGDSGGP

2、VVCNG-QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANCrayfish: GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV-缺失？缺失？保守序列保守序列保守序列：保守序列：可能是共同進化的標志可能是共同進化的標志可能并不代表功能的重要性可能并不代表功能的重要性插入？插入？當兩個序列非常相似時，是否一定當兩個序列非常相似時，是否一定說明它們具有相似的功能？說明它們具有相似的功能？第3頁/共77頁NCBI數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫NCBI首先創(chuàng)建首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 于于19911991年開發(fā)了年

3、開發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR和和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫的序列信等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及息以及MEDLINEMEDLINE有關(guān)序列的文獻信息，并通過相關(guān)鏈接，將有關(guān)序列的文獻信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地結(jié)合在一起他們有機地結(jié)合在一起NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳( (OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（MMDB）、人）、人類基因序列集成（類基因序列集成（UniGene）、人類基因組基因圖譜）、人類基因組基因圖

4、譜（GMHG）、生物門類（）、生物門類（Toxonomy） 等數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫第4頁/共77頁第5頁/共77頁1. 1. 各種數(shù)據(jù)庫的介紹各種數(shù)據(jù)庫的介紹(1) Nucleotide該數(shù)據(jù)庫由國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫成員美國該數(shù)據(jù)庫由國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫成員美國國立衛(wèi)生研究院國立衛(wèi)生研究院GenBank、日本、日本DNADNA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫( (DDBJ) )和英國和英國Hinxton Hall的歐洲分子生物學(xué)的歐洲分子生物學(xué)實驗室數(shù)據(jù)庫實驗室數(shù)據(jù)庫( (EMBL）三部分數(shù)據(jù)組成）三部分數(shù)據(jù)組成三個組織每天交換各自數(shù)據(jù)庫中的新增序列三個組織每天交換各自數(shù)據(jù)庫中的新增序列實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享第6頁/

5、共77頁(2) Genome即基因組數(shù)據(jù)庫，提供了多種基因組、完全染即基因組數(shù)據(jù)庫，提供了多種基因組、完全染色體、重疊序列圖譜以及一體化基因物理圖譜色體、重疊序列圖譜以及一體化基因物理圖譜(3) Structures即結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫或稱分子模型數(shù)據(jù)庫即結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫或稱分子模型數(shù)據(jù)庫( (MMDB) )，包含來自包含來自X X線晶體學(xué)和三維結(jié)構(gòu)的實驗數(shù)據(jù)線晶體學(xué)和三維結(jié)構(gòu)的實驗數(shù)據(jù)NCBI已經(jīng)將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉鏈接到書目信息、序列數(shù)據(jù)庫和已經(jīng)將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉鏈接到書目信息、序列數(shù)據(jù)庫和NCBI的的Taxonomy中運用中運用NCBI的的3D結(jié)構(gòu)瀏覽器和結(jié)構(gòu)瀏覽器和Cn3D，可以，可以很容易地從很容易地從En

6、trez獲得分子的分子結(jié)構(gòu)間相互作用的圖像獲得分子的分子結(jié)構(gòu)間相互作用的圖像第7頁/共77頁(4) Taxonomy即生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫，可以按生物學(xué)門類進行檢即生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫，可以按生物學(xué)門類進行檢索或瀏覽其核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)等索或瀏覽其核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)等(5) PopSet包含研究一個人群、一個種系發(fā)生或描述人群包含研究一個人群、一個種系發(fā)生或描述人群變化的一組組聯(lián)合序列變化的一組組聯(lián)合序列PopSet既包含了核酸序列數(shù)據(jù)又包含了蛋白質(zhì)既包含了核酸序列數(shù)據(jù)又包含了蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)序列數(shù)據(jù)第8頁/共77頁(7) (7) 文獻數(shù)據(jù)庫文獻數(shù)據(jù)庫PubMed：生物醫(yī)藥科學(xué)的檢索

7、系統(tǒng)生物醫(yī)藥科學(xué)的檢索系統(tǒng) OMIM：孟德爾遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫是人類基因和基孟德爾遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫是人類基因和基因疾病的目錄數(shù)據(jù)庫因疾病的目錄數(shù)據(jù)庫其他：書目，雜志，文章引用匹配等其他：書目，雜志，文章引用匹配等該數(shù)據(jù)庫包括原文信息、圖片和參考信息，該數(shù)據(jù)庫包括原文信息、圖片和參考信息，同時還可以鏈接到同時還可以鏈接到Entrez系統(tǒng)系統(tǒng)MEDLINE數(shù)數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻和序列信息據(jù)庫中相關(guān)文獻和序列信息 第9頁/共77頁2. NCBI數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)庫檢索 在檢索框中輸入檢索詞，檢索詞間默認邏輯關(guān)在檢索框中輸入檢索詞，檢索詞間默認邏輯關(guān)系為系為AND，檢索規(guī)則基本同，檢索規(guī)則基本同PubMed 可以通過下

8、拉菜單選擇記錄的顯示格式，通常選擇可以通過下拉菜單選擇記錄的顯示格式，通常選擇GenBank Report格式或格式或FASTA Report格式。格式。當選擇當選擇GenBank Report格式后，屏幕顯示較完整的基因記錄，包格式后，屏幕顯示較完整的基因記錄，包括：基因位點括：基因位點( (Locus）、基因定義）、基因定義( (Definition）、基因存取號）、基因存取號( (Accession）、）、 核酸編號核酸編號( (NID ）、關(guān)鍵詞）、關(guān)鍵詞( (Keywords）、）、 來源來源( (Source）、組織分類）、組織分類( (Organism) )、參考文獻、參考文獻(

9、 (Reference) )、 著者著者( (Author）、題目）、題目( (Title）、期刊）、期刊( (Journal）、）、Medline存取號存取號( (Medline）、序列特征）、序列特征( (Features）、基因）、基因( (Gene）、）、CDS（cDNA）、）、等位基因等位基因( (Allele） 對等的肽對等的肽( (Mat-Peptide ）、計算堿基數(shù)）、計算堿基數(shù)( (Base Count）、原序列）、原序列( (Origin）。）。而而FASTA Report格式僅包括檢出序列的簡要特征描述。格式僅包括檢出序列的簡要特征描述。第10頁/共77頁例如：人例如：

10、人EPOEPO基因序列檢索基因序列檢索輸入關(guān)鍵詞，選擇合適的程序輸入關(guān)鍵詞，選擇合適的程序第11頁/共77頁向下拉尋找符合目標的條目向下拉尋找符合目標的條目第12頁/共77頁點擊此條打開連接點擊此條打開連接第13頁/共77頁向下拉尋找關(guān)注的內(nèi)容向下拉尋找關(guān)注的內(nèi)容第14頁/共77頁凡是連接的地方都可以點擊查看凡是連接的地方都可以點擊查看可以直接拷貝保存相關(guān)內(nèi)容可以直接拷貝保存相關(guān)內(nèi)容第15頁/共77頁Entrez： 是一個用以整合是一個用以整合NCBI數(shù)據(jù)庫中信息的數(shù)據(jù)庫中信息的搜尋和檢索工具搜尋和檢索工具 3. 3. NCBI數(shù)據(jù)庫搜索工具數(shù)據(jù)庫搜索工具 BLAST：是一個是一個NCBINC

11、BI開發(fā)的序列相似搜索程序，還可作開發(fā)的序列相似搜索程序，還可作為鑒別基因和遺傳特點的手段為鑒別基因和遺傳特點的手段 NCBI提供的附加軟件工具有：開放閱讀框?qū)ひ捚魈峁┑母郊榆浖ぞ哂校洪_放閱讀框?qū)ひ捚鳎∣RF Finder），），電子電子PCR，和序列提交工具，和序列提交工具，Sequin和和BankIt Entrez的一個強大和獨特的特點的一個強大和獨特的特點是檢索相關(guān)的序列，結(jié)構(gòu)，和參考是檢索相關(guān)的序列，結(jié)構(gòu)，和參考文獻的能力文獻的能力 第16頁/共77頁Entrez:第17頁/共77頁BLAST:第18頁/共77頁BLAST程序程序程序程序 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 查詢查詢 內(nèi)容內(nèi)容Blastp

12、 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 使用取代矩陣尋找較遠的關(guān)系：使用取代矩陣尋找較遠的關(guān)系： 可以進行可以進行SEG過濾過濾Blastn 核苷酸核苷酸 核苷酸核苷酸 尋找較高分值的匹配，對較遠關(guān)系尋找較高分值的匹配，對較遠關(guān)系 不太適用不太適用Blastx 核苷酸核苷酸 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 對于新的對于新的DNA序列和序列和ESTs的分析極的分析極 （翻譯）（翻譯） 為有用為有用Tblastn 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 核苷酸核苷酸 對于尋找數(shù)據(jù)庫中沒有標注的編碼對于尋找數(shù)據(jù)庫中沒有標注的編碼 （翻譯）（翻譯） 區(qū)極為有用區(qū)極為有用Tblastx 核苷酸核苷酸 核苷酸核苷酸 對于分析對于分析EST極為有用極為有用 （

13、翻譯）（翻譯） （翻譯）（翻譯） 第19頁/共77頁點擊核酸序列點擊核酸序列blast，在框內(nèi)輸入序列：，在框內(nèi)輸入序列：第20頁/共77頁選擇搜索條件：選擇搜索條件：第21頁/共77頁選擇特殊程序：選擇特殊程序：第22頁/共77頁比較兩個序列之間的相似性：比較兩個序列之間的相似性：第23頁/共77頁 以上僅簡介了以上僅簡介了NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫及工具軟相關(guān)數(shù)據(jù)庫及工具軟件關(guān)于其他數(shù)據(jù)庫及軟件工具等信息見書中件關(guān)于其他數(shù)據(jù)庫及軟件工具等信息見書中第二十五章表第二十五章表1-51-5。第24頁/共77頁第二節(jié)第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)錄起始點的鑒定基因轉(zhuǎn)錄起始點的鑒定第25頁/共77頁主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：一、

14、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列特征一、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列特征二、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列分析二、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列分析第26頁/共77頁一、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列特征一、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列特征 TATA box CAAT box GC box 增強子增強子 順式作用元件順式作用元件 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因-GCGC-CAAT-TATA轉(zhuǎn)錄起始點轉(zhuǎn)錄起始點1. 1. 真核基因及其調(diào)控元件真核基因及其調(diào)控元件第27頁/共77頁II 型啟動子的型啟動子的TSS：沒有明確的保守序列沒有明確的保守序列有一種趨勢，即有一種趨勢，即mRNA 的第一個堿基是的第一個堿基是A，其側(cè)翼堿基傾向于是嘧啶其側(cè)翼堿基傾向于是嘧啶與與m

15、RNA第一個堿基對應(yīng)的位置標記為第一個堿基對應(yīng)的位置標記為-1 -1區(qū)區(qū)-3 +5-3 +5區(qū)域被稱作起始子區(qū)域被稱作起始子 ( (initiator) )2. 2. 轉(zhuǎn)錄起始點（轉(zhuǎn)錄起始點（TSS）+10+20Start site-10-20-30-40+1ATGATG-3+5Initiator Initiator PyPy2 2CAPyCAPy5 5第28頁/共77頁二、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列分析思考：思考：轉(zhuǎn)錄起始點轉(zhuǎn)錄起始點 ( (TSS) )位于基因編碼序列的位于基因編碼序列的5 5 端端基因編碼區(qū)是指能體現(xiàn)在多肽鏈中的核苷酸基因編碼區(qū)是指能體現(xiàn)在多肽鏈中的核苷酸序列序列多肽鏈是以多肽

16、鏈是以mRNA為模板經(jīng)翻譯合成的為模板經(jīng)翻譯合成的因此，因此，分析鑒定分析鑒定TSS的方法都是以的方法都是以cDNA為切入點為切入點第29頁/共77頁1. 1. cDNA克隆測序克隆測序AAAAAnAAAAAnAAAAAnmRNA反轉(zhuǎn)錄酶AAAAAnOligo (dT)15-18TTTTT15-18cDNA第一鏈CCCCCTTTTT15-18cDNA第一鏈nCCCCnGGGGcDNA第二鏈克隆擴增，5端測序分析反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性O(shè)ligo (dG)15-18mRNA與線性載體相連接要求：cDNA的5端完整無缺第30頁/共77頁2. 2. cDNA末端快速擴增技術(shù)末端快速擴增技術(shù)( (RA

17、CE) )傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的RACE：AAAAAnmRNAAAAAAnTTTTT15-18cDNAmRNA-53-反轉(zhuǎn)錄酶Oligo (dT)15-18末端轉(zhuǎn)移酶dGTPTTTTT15-18nGGGGG錨定PCR擴增TTTTT15-18nGGGGGnCCCCC錨定引物特異引物PCR產(chǎn)物第31頁/共77頁Deep-RACE： 用寡核苷酸替代mRNA的5端帽結(jié)構(gòu)以及發(fā)光標記巢氏PCR引物實現(xiàn)高通量鑒定轉(zhuǎn)錄起始點 AAAAAn5-p 帽mRNA牛小腸磷酸酶 (CIP)AAAAAn5-帽煙草酸焦磷酸酶 (TAP) AAAAAn5-將5-RACE adaptor (寡核苷酸)加到脫帽RNA分子上AAAAAn5

18、-RACE adaptor (寡核苷酸)反轉(zhuǎn)錄酶10nt 隨機引物第32頁/共77頁5-RACE adaptor5-RACE adaptor5-RACE adaptor5-RACE adaptor長短不同的cDNA隨機引物用10nt隨機引物與5-RACE引物進行PCR擴增5-RACE adaptor5-RACE adaptor5-RACE adaptor5-RACE adaptorPCR產(chǎn)物隨機引物以5-RACE引物和5端甩尾的基因特異性反向引物進行巢氏PCR 5-RACE adaptor以5-RACE發(fā)光標記引物對PCR混合物直接進行一次性測序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點第33頁/共77頁3.3.連續(xù)

19、分析基因轉(zhuǎn)錄起始點連續(xù)分析基因轉(zhuǎn)錄起始點 在RACE的基礎(chǔ)上，通過在轉(zhuǎn)錄本5 端引入一個特殊的II型限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，實現(xiàn)了基因5 端短片段串聯(lián)連接產(chǎn)物一次測序分析多個基因轉(zhuǎn)錄起始點的目的主要有兩種方法：主要有兩種方法：5 端連續(xù)分析基因表達（5 -end serial analysis of gene expression, 5 SAGE）帽分析基因表達（cap analysis gene expression, CAGE）第34頁/共77頁(1) 5 SAGE5SAGE是在PCR過程中將MmeI酶切位點引物cDNA的5端，通過酶切和連接獲得不同短片段重復(fù)序列，并對重復(fù)序列進行測序獲

20、得大量片段序列信息 不同序列的短片段代表不同基因的轉(zhuǎn)錄起始點 (TSS) MmeI:是一種特殊的II型限制性核酸內(nèi)切酶識別的序列不是回文結(jié)構(gòu)，而是不對稱的DNA序列5-TCCRAC-3（R代表G或A）在識別位點下游1820堿基處切開雙鏈DNA 第35頁/共77頁GpppAAAAAAAAnmRNA用BAP和TAP處理AAAAAAAAnp在RNA的5端加上寡核苷酸帽AAAAAAAAn5XhoIMmeI反轉(zhuǎn)錄酶RT5AAAAAAAAn5cDNAPCRBiotin-標記引物隨機引物55BiotinMmeI酶切消化520 mer5Biotin親和素用親和素-生物素，可以將5-端片段與其他片段分離開第36

21、頁/共77頁520 mer連接5Biotin5Biotin520 merPCR擴增55Biotin5Biotin5XhoI酶切消化自身連接串聯(lián)體測序分析第37頁/共77頁(2) CAGECAGE與5SAGE非常相似所不同的是:CAGE不需要在RNA上加接頭，而是用oligo(dT)引物先進行第一鏈cDNA的合成然后通過捕獲帽結(jié)構(gòu)，將含有MmeI和另一內(nèi)切酶位點如XmaJI的linker加到單鏈全長cDNA的3末端 第38頁/共77頁AAAAAAnCapmRNA反轉(zhuǎn)錄酶Oligo (dT)1518AAAAAAnCapTTTTTTTncDNA捕獲5-帽結(jié)構(gòu)單鏈linker連接TTTTTTTnBio

22、tincDNA第二鏈的合成TTTTTTTnAAAAAAnMmeIXmaJIMmeI酶切親和素20 mer用親和素-生物素，可以將5-端片段與其他片段分離開第39頁/共77頁連接第二個linkerXbaIXmaJIXmaJI, Xbal酶切消化PCR（用linker1和linker2作引物）Linker 1Linker 2純化，串聯(lián)連接，克隆20 merXmaJI和XbaI是同尾酶：XmaJI：CCTAGGXbaI： TCTAGA串聯(lián)體測序分析第40頁/共77頁第三節(jié)第三節(jié) 啟動子的結(jié)構(gòu)及功能分析啟動子的結(jié)構(gòu)及功能分析第41頁/共77頁主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：一、啟動子的結(jié)構(gòu)分析一、啟動子的結(jié)構(gòu)分析

23、二、啟動子的功能分析二、啟動子的功能分析第42頁/共77頁啟動子（啟動子（promoter）是一段能被蛋白質(zhì)識別的、參與特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列II型啟動子通常位于結(jié)構(gòu)基因的上游共通序列(consensus sequence)是其特征性序列共通序列和啟動子所處的位置是研究啟動子的重要線索第43頁/共77頁+10+20Start site-10-20-30-40+1ATGATG-3+5Initiator Initiator 共通序列共通序列例如：原核基因的共通序列：-10區(qū)：Pribnow box（T77A76T60A61A56T82序列）-35區(qū)：T69T79G61A56C54A54 序列

24、 真核基因的共通序列： 真核基因啟動子在-50區(qū)域附近（大約5%30%基因啟動子在-25-30區(qū)域）有TATA box（TATAAA序列）TATAATTTGACA第44頁/共77頁一、啟動子的結(jié)構(gòu)分析一、啟動子的結(jié)構(gòu)分析主要方法：主要方法：利用利用PCR技術(shù)克隆啟動子技術(shù)克隆啟動子利用核酸利用核酸- -蛋白質(zhì)相互作用方法研究啟動子蛋白質(zhì)相互作用方法研究啟動子生物信息學(xué)預(yù)測啟動子生物信息學(xué)預(yù)測啟動子第45頁/共77頁（一）利用（一）利用PCRPCR技術(shù)克隆啟動子技術(shù)克隆啟動子特異性基因序列基因上游序列基因組DNA根據(jù)基因序列合成一條反向引物正向引物用隨機引物PCR擴增隨機引物特異引物克隆及測序分

25、析注意：真核基因有內(nèi)含子，應(yīng)該根據(jù)mRNA序列設(shè)計特異性引物特異性引物盡可能靠近基因的5端1. 1. 根據(jù)已知基因序列直接進行根據(jù)已知基因序列直接進行PCR擴增擴增第46頁/共77頁2. 2. 利用利用TSS釣取啟動子釣取啟動子AAAAAAnCap 5-mRNA反轉(zhuǎn)錄AAAAAAnTTTTTTncDNA插入載體，克隆擴增Cap 5-以基因特異引物與載體引物配對PCR擴增5-測序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點序列以TSS序列為引物，基因組序列為模板，與隨機引物配對進行TSS上游序列的PCR擴增第47頁/共77頁3. 3. 利用環(huán)狀利用環(huán)狀PCR釣取啟動子釣取啟動子基因組DNA酶切消化基因組DNA片段直接環(huán)化

26、連接加上接頭后環(huán)化連接根據(jù)基因上游序列設(shè)計一對反向互補引物PCR擴增根據(jù)接頭序列設(shè)計引物PCR擴增克隆測序分析克隆測序分析接頭第48頁/共77頁（二）利用核酸（二）利用核酸- -蛋白質(zhì)互作方法研究啟動子蛋白質(zhì)互作方法研究啟動子啟動子是一段能被蛋白質(zhì)識別和結(jié)合的DNA序列，因此，能夠檢測核酸-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法都可以用于啟動子的研究中 主要方法：足跡法（酶足跡法，化學(xué)足跡法）電泳遷移率變動實驗（EMSA）染色體免疫沉淀（ChIP）第49頁/共77頁1. 1. 用足跡法研究啟動子用足跡法研究啟動子足跡法（Footprinting）利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA

27、區(qū)域 基本流程：DNA與蛋白質(zhì)相互作用切割DNA凝膠電泳分析電泳圖譜蛋白與未標記的競爭DNA結(jié)合蛋白與標記的DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影第50頁/共77頁（1 1）酶足跡法）酶足跡法 ( (Enzymatic footprinting) ) 利用能切割DNA的酶處理DNA-蛋白質(zhì)混合物，然后通過電泳進行分析 DNase I足跡法足跡法 (DNase I footprinting) 是一種利用DNase I 隨機切割雙鏈DNA，從而確定DNA結(jié)合蛋白在DNA上結(jié)合位點的方法 核酸外切酶核酸外切酶IIIIII足跡法足跡法 (Exonucleoase III footprinting) 是利用核酸外

28、切酶III（Exo III）的35外切酶活性從3末端切割雙鏈DNA的特性，確定蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點的常用方法 第51頁/共77頁DNase I 足跡法足跡法dsDNA單鏈末端標記DNA結(jié)合蛋白DNase I酶切消化（控制反應(yīng)時間）產(chǎn)生長短不同的片段但蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)被保護第52頁/共77頁蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)MNo-proPro-DNA對在凝膠上出現(xiàn)空白區(qū)域的DNA進行克隆測序，即可確定結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列變性凝膠電泳第53頁/共77頁（2 2）化學(xué)足跡法）化學(xué)足跡法 ( (Chemical footprinting) ) 是利用能切斷DNA骨架的化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而通過化學(xué)試劑

29、無法接近結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域而確定DNA的蛋白質(zhì)結(jié)合位點主要方法：羥自由基足跡法 體內(nèi)足跡法第54頁/共77頁1 1）羥自由基足跡法）羥自由基足跡法（Hydroxyl radical footprinting） 化學(xué)試劑羥自由基利用化學(xué)試劑產(chǎn)生的羥自由基攻擊DNA分子表面脫氧核糖骨架使DNA斷裂當DNA結(jié)合蛋白將脫氧核糖遮蓋時，自由羥基無法攻擊而使這個區(qū)域的DNA受到保護 電泳圖譜上出現(xiàn)空白區(qū)的地方就是結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA變性凝膠電泳第55頁/共77頁2 2）體內(nèi)基足跡法）體內(nèi)基足跡法（In vivo footprinting） 用化學(xué)試劑對活細胞進行體內(nèi)處理，使DNA在細胞內(nèi)受到化學(xué)修飾，然

30、后裂解細胞，用化學(xué)法或酶法進行足跡實驗。 甲基化干擾實驗甲基化干擾實驗 (Methylation interference assay) 是利用化學(xué)試劑如硫酸二甲酯（Dimethyl sulfate, DMS）對活細胞DNA進行甲基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。 乙基化干擾實驗乙基化干擾實驗 (Ethylation interference assay) 是利用化學(xué)試劑對活細胞DNA進行乙基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。 第56頁/共77頁化學(xué)試劑提取DNADNase I 或化學(xué)試劑變性凝膠電泳分析切割DNA化學(xué)修飾對蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合有干擾，因此，體內(nèi)足跡實驗也叫干擾實驗電

31、泳圖譜需與未修飾的DNA樣品進行比較，在未修飾樣品中出現(xiàn)空白區(qū)的位置是體內(nèi)發(fā)生化學(xué)修飾的DNA區(qū)域正常對照化學(xué)修飾提取DNA第57頁/共77頁2. 2. 用電泳遷移率變動實驗研究啟動子用電泳遷移率變動實驗研究啟動子電泳遷移率變動實驗電泳遷移率變動實驗 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)是利用結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA片段在凝膠中遷移滯后的特點，通過電泳分離研究核酸-蛋白質(zhì)互作的方法又稱為凝膠阻滯實驗(Gel retardation assay)第58頁/共77頁細胞蛋白質(zhì)提取物標記的DNA片段蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物電泳遷移滯后凝膠電

32、泳顯影滯后條帶表明DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域第59頁/共77頁3. 3.用染色體免疫沉淀技術(shù)研究啟動子用染色體免疫沉淀技術(shù)研究啟動子染色體免疫沉淀染色體免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)是在保持蛋白質(zhì)與染色體DNA結(jié)合的同時，將染色體切割成小片段并沉淀下來 非變性非變性ChIP：是先用核酸酶處理細胞核，將染色體消化成碎片，然后用合適的抗體將結(jié)合有蛋白質(zhì)的染色體片段通過免疫沉淀選擇出來，再以PCR或核酸雜交技術(shù)對DNA序列進行分析 變性變性ChIP：是先用甲醛處理細胞，使蛋白質(zhì)與DNA在細胞內(nèi)發(fā)生交聯(lián)，然后分離染色體并進行剪切，用特異性抗體與DNA

33、結(jié)合蛋白相結(jié)合，以沉淀法分離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體 前面章節(jié)已介紹，這里不再詳述第60頁/共77頁（三）生物信息學(xué)預(yù)測啟動子（三）生物信息學(xué)預(yù)測啟動子真核基因組的測序正在以不斷增長的速度進行著，目前已經(jīng)可以獲得大約50個完整真核生物基因組的序列信息，預(yù)計在未來幾年內(nèi)將會完成更多的基因組測序工作對基因組注釋工作中最難的就是精確鑒定和描繪啟動子，因此，啟動子的預(yù)測就顯得非常重要 預(yù)測啟動子的切入點啟動子的結(jié)構(gòu)特征啟動子在染色體上的位置第61頁/共77頁1. 1. 啟動子的結(jié)構(gòu)特征啟動子的結(jié)構(gòu)特征典型啟動子核心啟動子：一般在TSS上游-35區(qū)域以內(nèi)近端啟動子：一般涉及TSS上游幾百個堿基遠端啟動子：一

34、般涉及TSS上游幾千個堿基 含有增強子或沉默子一些特征性的結(jié)構(gòu) TSS附近的CG島經(jīng)常出現(xiàn)在啟動子中共通序列 (consensus sequence)第62頁/共77頁2. 2. 啟動子的預(yù)測分析啟動子的預(yù)測分析EPD (Eukaryotic promoter databases)TRRD (Transcription regulatory regions databases)基因轉(zhuǎn)錄起始點數(shù)據(jù)庫 (DBTSS) 啟動子數(shù)據(jù)庫啟動子數(shù)據(jù)庫 這些數(shù)據(jù)庫主要通過計算機識別、判斷及分析，在數(shù)據(jù)庫中尋找啟動子的特異性特征結(jié)構(gòu)。第63頁/共77頁二、啟動子的功能分析二、啟動子的功能分析啟動子通常是基因上

35、游參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列。由于啟動子中的順式作用元件在基因的特異性表達中發(fā)揮重要作用，因此，可以通過連接報告基因研究啟動子的功能。1. 1. 報告基因報告基因 ( (Reporter gene) )是研究者們?yōu)榱酥圃煲环N可在細胞培養(yǎng)條件下或動植物體內(nèi)作為篩選標志的易檢測信號，通過分子生物學(xué)操作將發(fā)光蛋白或酶的編碼基因附加到一個感興趣基因上或插入基因調(diào)控序列下游，從而監(jiān)測感興趣基因的表達或分析基因調(diào)控序列的活性 。第64頁/共77頁常用的報告基因常用的報告基因熒光蛋白編碼基因：綠色熒光蛋白 (GFP)紅色熒光蛋白 (dsRed)蛋白酶：熒光素酶 (luciferase)-半乳糖苷酶能催化熒

36、光素 (luciferin)發(fā)生氧化反應(yīng)發(fā)光能使細菌在X-gal存在條件下變成藍色第65頁/共77頁2. 2. 報告基因的應(yīng)用報告基因的應(yīng)用監(jiān)測基因的轉(zhuǎn)染效率監(jiān)測基因的轉(zhuǎn)染效率 報告基因與目的基因分別插入各自啟動子下游，實現(xiàn)報告基因的組成性表達模式監(jiān)控目的基因的表達監(jiān)控目的基因的表達 報告基因與目的基因融合共同受控于一個啟動子，報告基因的表達即代表目的基因的表達研究啟動子的活性研究啟動子的活性 報告基因插入被研究啟動子下游，通過觀察報告基因的表達情況推測啟動子活性第66頁/共77頁啟動子捕獲技術(shù) (promoter trapping)：是一種研究啟動子活性的篩選方法基本流程：構(gòu)建啟動子捕獲載體觀察報告基因的表達 報告基因MCSori候選啟動子序列插入MCS轉(zhuǎn)染細胞觀察報告基因的表達啟動子捕獲載體第67頁/共77頁第四節(jié)第四節(jié) 編碼序列結(jié)構(gòu)分析編碼序列結(jié)構(gòu)分析 第68頁/共77頁編碼序列編碼序列 ( (coding sequence) )： 通常是指能體現(xiàn)在蛋白質(zhì)氨基酸序列中的基因信息 主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征二、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)分析二、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)分析第69頁/共77頁一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征基因的編碼序列具有一些特征性序列比如：開放閱讀框架蛋白質(zhì)翻譯的起始密碼子和終止密碼子真核基因