低密度脂蛋白對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌系膜基質(zhì)的影響

1、    低密度脂蛋白對(duì)大鼠腎小球 系膜細(xì)胞分泌系膜基質(zhì)的影響        【摘要】目的應(yīng)用培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(MSC)，在體外研究低密度脂蛋白(LDL)對(duì)MSC分泌型膠原以及層粘連蛋白(LN)mRNA表達(dá)的影響。方法用不同濃度人血提純的LDL(0,25,50,100,150,200g/ml)與第310代轉(zhuǎn)種的大鼠MSC共同孵育48小時(shí)后,ELISA法測定培養(yǎng)上清液中型膠原的含量,并提取細(xì)胞總RNA經(jīng)Northern雜交檢測LN mRNA的表達(dá)。結(jié)果LDL在5

2、0g/ml濃度時(shí)即可刺激MSC分泌型膠原蛋白,并增加LN mRNA的表達(dá),且隨LDL濃度的增加型膠原的分泌及LN mRNA的表達(dá)也增加。結(jié)論LDL可能通過刺激MSC產(chǎn)生過多的細(xì)胞外基質(zhì)而在腎小球硬化的過程中起重要作用。【關(guān)鍵詞】腎小球膜脂蛋白類，LDL膠原層粘連蛋白R(shí)NA，信使The effect of low density lipoproteins on the production of extracellular matrix by cultured rat mesangial cells in vitroSONG Hongmei, LI Xuewang, WEI Min, et al

3、. Department of Pediatrics and Internal Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730【Abstract】ObjectiveHyperlipidemia and abnormalities in lipid metabolism may contribute to the progression of renal injury, in which increased LDL was proven to

4、be an important factor. The aim of this study was to determine the effect of LDL on the production of type collagen and mRNA expression of laminin (LN) by cultured rat mesangial cells in vitro. MethodsLDL was prepared from normal human plasma. Subconfluent mesangial cells monolayers grown in serum-f

5、ree culture medium for 24 hr were challenged with LDL (0, 25, 50, 100, 150, 200 g/ml) for 48 hr. Production of type collagen in the culture medium was evaluated with an ELISA kit; total RNA was extracted from mesangial cells treated with all concentrations of LDL, and Northern blotting was performed

6、 with cDNA for LN. ResultsLDL stimulated type collagen production and LN mRNA expression in the concentrtion of 50 g/ml. Secretion of type collagen and expression of LN mRNA increased as LDL concentration increased. ConclusionLDL may play an important role in the pathogenesis of glomerulosclerosis b

7、y stimulating the accumulation of extracellular matrix.【Key words】Glomerular mesangiumLipoproteins,LDLCollagenLamininRNA, messenger在各種腎臟疾病所致的脂代謝紊亂中，低密度脂蛋白(LDL)的異常升高倍受關(guān)注。國內(nèi)外研究結(jié)果已表明了LDL與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，腎小球硬化與動(dòng)脈粥樣硬化病理生理機(jī)制類似，所以最近LDL與腎小球硬化的關(guān)系成為腎臟病學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一。我們應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，研究了LDL對(duì)腎小球系膜細(xì)胞(MSC)分泌系膜基質(zhì)成分型膠原及層粘連蛋白(L

8、N)的影響，以期進(jìn)一步從細(xì)胞及分子水平探討LDL導(dǎo)致腎小球損傷的機(jī)制。材料和方法一、材料1.所用實(shí)驗(yàn)鼠情況：采用解放軍總醫(yī)院動(dòng)物室提供的SD大鼠，雄性，一級(jí)，體重80100 g。2.MSC的分離、培養(yǎng)與鑒定1-3：5只SD大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，分離其腎皮質(zhì)，混合后剪碎并輕輕碾壓，分別過150目(110 m)、80目(216 m)及200目(75 m)細(xì)胞分樣篩，收集腎小球，用400 g/ml膠原酶5 ml 37消化30分鐘，用含20胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將腎小球懸浮至塑料培養(yǎng)瓶中，CO2恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2,37)孵育，20天左右MSC長滿瓶底后進(jìn)行轉(zhuǎn)種。相差顯微鏡可見細(xì)胞胞體呈梭

9、形、不規(guī)則星形及三角形，中央有一清晰的卵圓形核，胞漿中見微絲結(jié)構(gòu)，肌動(dòng)蛋白間接免疫熒光染色陽性。透射電鏡檢查可見細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)，掃描電鏡可見細(xì)胞表面微絲束隆起，用10-8 mmol/L血管加壓素刺激可導(dǎo)致MSC收縮。二、方法1.MSC分泌型膠原的檢測：取第310代轉(zhuǎn)種的MSC消化后用含20FCS的RPMI 1640稀釋至細(xì)胞數(shù)2000個(gè)/ml，取1 ml接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞將要鋪滿孔底后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)(使細(xì)胞表面LDL受體上調(diào))，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用無血清培養(yǎng)基配制不同劑量的LDL(0,25,50,100,150,200 g/ml)(人血提純的LDL, 27 mg/ml, 由醫(yī)

10、科院基礎(chǔ)所生化室提供)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集上清-20貯存待測。型膠原的檢測采用日本富士藥品工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)的型膠原檢測試劑盒(ELISA法)，以不同濃度的型膠原標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm波長的吸光度(A，曾稱光密度OD)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)其公式Y(jié)=-40.824476.61(A)計(jì)算測定樣品的濃度。2.MSC表達(dá)LN mRNA的測定：取第310代MSC轉(zhuǎn)種于200ml塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞接近長滿瓶底時(shí)，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入不同濃度的LDL(0,25,50,100, 150,200 g/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，用Promega公司的RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA

11、，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將已轉(zhuǎn)膜烤干的硝酸纖維素膜及預(yù)雜交液(5×SSC, 0.1%N-Laurolsarcosine, 0.02%SDS,1%阻斷液)裝入雜交袋中，68預(yù)雜交3小時(shí)。取Dig標(biāo)記好的LN探針(由美國NIH Yoshihiko Yamada教授贈(zèng)送)5l(約200ng)在沸水中煮沸10分鐘后加入預(yù)雜交液中，68雜交1618小時(shí)。Dig檢測試劑盒進(jìn)行免疫顯色16小時(shí)，然后用二甲基酰胺清除膜上的探針，待藍(lán)色褪盡后用-actin探針(基礎(chǔ)所神經(jīng)免疫室贈(zèng)送)重新雜交。3.統(tǒng)計(jì)分析：試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不同組之間的比較應(yīng)

12、用StartView統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析，當(dāng)P值<0.05時(shí)差異有顯著意義。結(jié)果一、LDL對(duì)MSC分泌型膠原的影響LDL在50 g/ml濃度時(shí)MSC 型膠原的分泌即開始增多，并隨著LDL濃度的增加型膠原的分泌也增加(F=18.360,P<0.001)。見(表1)。二、LDL對(duì)MSC LN mRNA表達(dá)的影響用LN(B2鏈)cDNA探針與經(jīng)LDL處理的MSC總RNA進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果經(jīng)光密度掃描儀定量分析并以-actin作為內(nèi)參照以校正RNA加樣量。結(jié)果表明，LDL在50g/ml濃度時(shí)即可刺激MSC LN mRNA表達(dá)增加，并隨著LDL濃度的增加，LN mRNA的表

13、達(dá)也增強(qiáng)(表1，1)表1不同濃度的LDL對(duì)MSC分必型膠原和對(duì)MSC LN mRNA表達(dá)的影響LDL濃度(g/ml)型膠原濃度LN mRNA表達(dá)標(biāo)本數(shù)(只)±s(ng/ml)標(biāo)本數(shù)(只)LN/-actin吸光度值(A)0631±630.38±0.0425633±1030.42±0.0450660±16*30.62±0.05*100688±23*30.61±0.09*1506102±25*30.92±0.10*2006133±34*31.01±0.03*F值18.36

14、049.818P值0.010.01注：與未加LDL組比較，*P0.05，*P0.01;與前一濃度LDL組比較，P0.05，P0.011MSC LN mRNA表達(dá)的Northern雜交結(jié)果討論已知LDL及其修飾產(chǎn)物如氧化LDL(OX-LDL)在MSC的增殖及腎小球硬化的過程中起一定作用。LDL不僅可以引起MSC增殖，還可以刺激培養(yǎng)的MSC產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。90年代以來對(duì)LDL刺激系膜基質(zhì)合成的體外研究逐漸增多。Kamanna等4和Keane等5分別報(bào)道了LDL和OX-LDL刺激MSC膠原的合成以及型膠原mRNA的表達(dá)。Rovim和Tan6發(fā)現(xiàn)MSC與LDL共同孵育后，上清液中纖維粘連蛋白

15、(FN)含量顯著增多并呈時(shí)間、劑量依賴性。我院腎內(nèi)科以前的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)LDL及OX-LDL對(duì)FN的合成有促進(jìn)作用并和劑量有關(guān)。但目前尚未見關(guān)于LDL對(duì)MSC產(chǎn)生及分泌LN的報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LDL在50g/ml濃度即可刺激MSC 型膠原的分泌及LN mRNA的表達(dá)，而且隨著劑量的增加其合成及表達(dá)也增加，與國外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。但本實(shí)驗(yàn)與以往研究中LDL的作用濃度略有不同，例如Kamanna等4認(rèn)為LDL在1020 g/ml 時(shí)即增加膠原的合成；而Kim等7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為LDL在100 g/ml時(shí)刺激MSC 型膠原的產(chǎn)生。分析其原因可能有：(1)與LDL的純度有關(guān)；(2)是否及時(shí)應(yīng)用，因

16、為LDL放置后易被氧化形成氧化修飾的LDL；(3)不同的蛋白測定方法測定的LDL濃度也有不同；(4)LDL的作用可能受到細(xì)胞周期、受體密度及細(xì)胞因子的自分泌等多種因素影響。正常大鼠血漿LDL濃度為120g/ml，但其在正常情況下并不引起腎臟損傷。可能由于(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的負(fù)電荷可使過濾到系膜區(qū)的LDL濃度明顯減低7；(2)在體內(nèi)有HDL的保護(hù)作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的研究表明HDL可以拮抗LDL的損傷作用8；另外，體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境非常復(fù)雜，LDL在體內(nèi)的作用可能受到各種因素的影響。LDL導(dǎo)致ECM累積的機(jī)制目前認(rèn)為是由于其腎內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄增加導(dǎo)致合成增多以及金屬蛋白酶組織抑制因子(TIM

17、P)產(chǎn)生增加導(dǎo)致降解減少而共同作用的結(jié)果9。Kim等7發(fā)現(xiàn)LDL刺激型膠原mRNA及TIMP-2 mRNA的表達(dá)，但對(duì)膠原酶mRNA的表達(dá)無作用，所以型膠原合成增加而降解減少。Rovin和Tan6的研究也表明LDL導(dǎo)致的FN增多與FN mRNA水平呈正相關(guān)并可能通過受體途徑介導(dǎo)。本研究未做關(guān)于膠原酶及TIMP等的研究，但LN mRNA的表達(dá)增加表明LDL可能通過增加基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致系膜基質(zhì)的合成增多。關(guān)于LDL對(duì)MSC的作用，可能是LDL通過腎小球?yàn)V過至系膜區(qū)后直接刺激MSC，或通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤的單核細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子及生長因子而起作用，如血小板源生長因子(PDGF)、白細(xì)胞介素1(I

18、L-1)、轉(zhuǎn)代生長因子-(TGF-)等，其中TGF-最為重要，其對(duì)多種ECM的基因表達(dá)有很強(qiáng)的刺激作用，并能夠抑制某些細(xì)胞間質(zhì)降解酶的活性，刺激TIMP-1的活性，最終結(jié)果導(dǎo)致ECM累積10-11?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LDL可以刺激MSC 型膠原的產(chǎn)生，增加LN mRNA的表達(dá)，并與劑量有關(guān)。進(jìn)一步在體外從細(xì)胞及分子水平證實(shí)了LDL通過刺激MSC產(chǎn)生過多的ECM而在腎小球硬化的過程中起重要作用。作者單位: 100730 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院兒科(宋紅梅、魏珉、朱傳?),腎內(nèi)科(李學(xué)旺)參考文獻(xiàn)1Kreisberg JI, Karnovsky MJ. Glomerular

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20、dized IDL stimulate collagen synthesis by mesangial cells (Abstract). J Am Soc Nephrol, 1992, 3:634.5Keane WF, Kasiske BL, ODonnell MP, et al. Oxidized low density lipoprotein increases mesangial cell expression of type collagen mRNA (Abstract). J Am Soc Nephrol, 1992, 3:635.6Rovin BH, Tan LC. LDL stimulates mesangial fibronectin production and chemoattractant expression. Kidney Int, 1993, 43:218-225.7Kim SB, Kang SA, Cho YJ, et al. Effects of low density lipoprotein on type collagen producti