香菇多糖對(duì)荷瘤小鼠TDCs表達(dá)的影響

1、香菇多糖對(duì)荷瘤小鼠TDCs表達(dá)的影響                        作者：林卡莉， 林卡勤， 鐘瑞沖， 賀方興， 陳衛(wèi)琴【摘要】  目的探討香菇多糖對(duì)荷瘤小鼠S100+ 胸腺樹突狀細(xì)胞(TDCs)和CD1a+ TDCs表達(dá)的影響。方法觀察胸腺結(jié)構(gòu);通過S100和CD1a免疫組化標(biāo)記，S100+細(xì)胞在參照物(胸腺)中所占面積百分比;計(jì)

2、算TDCs密度;測(cè)算胸腺指數(shù)，腫瘤指數(shù)，抑瘤率等指標(biāo)。結(jié)果荷瘤香菇多糖組TDCs數(shù)量明顯增加，特別在胸腺皮質(zhì)密度很高，位于成簇的淋巴細(xì)胞之間，樹狀突起與淋巴細(xì)胞相接觸。荷瘤香菇多糖組S100+ TDCs所占面積比和TDCs密度均比其他各組明顯增高(P<0.01)。結(jié)論香菇多糖能增加TDCs數(shù)量及促進(jìn)其分化成熟。 【關(guān)鍵詞】  香菇多糖; S180; 樹突狀細(xì)胞; 免疫組織化學(xué)Abstract：ObjectiveTo explore the influence of lentina on expression of thymus S100+ dendritic cells (DC

3、s) and CD1a+ DCs in S180 tumor-bearing mice.MethodsThymus morphology and thymus DCs (TDCs)immunostaining with DCs marker(including S100 and CD1a) were observed and analyzed with stereologic method.The thymus index and tumor index were measured.ResultsThere were more TDCs in the tumor lentinan group

4、than others , especially in cortex, locating between lymphocytes. S100+ TDCs area and TDCs density in the tumor lentinan group were significantly higher than others(P<0.01) .ConclusionLentinan can promote quantity increase, differeation and maturation of TDLs.Key words：Lentinan; S180; Dendritic c

5、ell; Immunohistochemistry中醫(yī)理論認(rèn)為香菇味甘性平，健脾益氣，調(diào)和陰陽(yáng)，食藥兼用，民間還用其輔助多種病癥。從香菇的子實(shí)體提取物中獲取的主要有效成分香菇多糖，作為一種天然的免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)各種惡性腫瘤有較好的防治作用1。研究報(bào)道，香菇多糖可增強(qiáng)腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化、增殖，增強(qiáng)免疫功能的作用2,3。Mushiake等4的研究結(jié)果還表明：香菇多糖能通過改善樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)功能，調(diào)節(jié)DCs介導(dǎo)的特異性免疫，增強(qiáng)抗瘤活性，最終提高荷瘤鼠的存活率。本課題組的前期研究工作也證實(shí)香菇多糖抗腫瘤作用與增加免疫

6、細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，可使脾指數(shù)增加，脾白髓面積與脾小體個(gè)數(shù)增加，使外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)增加5,6。在此基礎(chǔ)上，我們重點(diǎn)觀察了香菇多糖對(duì)荷瘤S180鼠胸腺結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)胸腺樹突狀細(xì)胞(thymus dendritic cells,TDCs)分布和數(shù)量的影響，以及與腫瘤消長(zhǎng)的關(guān)系，以期進(jìn)一步為香菇多糖促進(jìn)中樞免疫器官功能，加強(qiáng)抗腫瘤作用的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料1.1 材料與試劑小鼠S180細(xì)胞株(Sarcoma180)由醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究所購(gòu)進(jìn)，本院科研中心傳代培養(yǎng)。兔抗小鼠S100，兔抗小鼠CD1a和SABC試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。注射用香菇多糖生產(chǎn)廠家：南京康海藥業(yè)有限公司。環(huán)磷酰

7、胺生產(chǎn)廠家：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。DT2000圖像分析軟件V2.0。SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件包。1.2 荷瘤S180鼠模型的建立取已接種7 d腫瘤生長(zhǎng)良好的S180腹水型小鼠，抽吸乳白色的濃稠腹水以無(wú)菌生理鹽水稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107，制成腫瘤細(xì)胞懸液(活細(xì)胞率95%)。在小鼠右前腋皮下注射0.2 ml S180細(xì)胞懸液，制成實(shí)體瘤模型。2方法2.1 動(dòng)物及分組清潔級(jí)昆明小鼠40只，雌雄各半，68周齡，體質(zhì)量2024 g，購(gòu)自江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，衛(wèi)生許可證號(hào)：SCXK(贛)2006-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)： JZDW 2008-02

8、05。小鼠隨機(jī)分為4組。第組為正常鹽水對(duì)照組，右前腋皮下注射0.2 ml生理鹽水，9 d后處死;第組為荷瘤模型組，第組為荷瘤環(huán)磷酰胺組，第組為荷瘤香菇多糖組，這3組于接種腫瘤后第2天始分別每日腹腔注射生理鹽水0.2 ml，環(huán)磷酰胺0.2 ml(每只每次1 mg)，以及香菇多糖0.2 ml(每只每次0.025 mg)，共7次，均于最后1次給藥后第2日處死。2.2 普通光鏡檢查小鼠斷頭處死，剝離胸腺組織，稱重后入4%多聚甲醛溶液中固定。低溫石蠟包埋制片，HE染色，Olympus顯微鏡觀察。2.3 免疫組織化學(xué)標(biāo)記和觀察分析將胸腺石蠟標(biāo)本制成厚4 m的石蠟切片。0.1%胰蛋白酶消化30 min(37

9、)，一抗4過夜(S100和CD1a工作濃度均為1150)。余按試劑盒作SABC免疫組化技術(shù)處理。DAB顯色。不復(fù)染或1%甲基綠輕度復(fù)染。陰性對(duì)照樣品：以PBS代替一抗進(jìn)行標(biāo)記。用DT2000圖像分析軟件V2.0計(jì)數(shù)單位面積胸腺切片中陽(yáng)性顆粒的個(gè)數(shù)和面積，計(jì)算S100+細(xì)胞在參照物(胸腺)中所占面積百分比。使用DigiLab 2.0、Motic Images Plus 2.0 ML軟件計(jì)算TDCs密度：每組隨機(jī)選取50個(gè)高倍視野拍照(0.068 mm2)，計(jì)數(shù)S100+細(xì)胞的個(gè)數(shù)。TDCs密度=50個(gè)高倍視野S100+細(xì)胞總和/3.4 mm2(陽(yáng)性顆粒最小直徑 2 m 時(shí)認(rèn)作一個(gè)細(xì)胞)。2.4

10、胸腺指數(shù)，腫瘤指數(shù)，抑瘤率的計(jì)算胸腺指數(shù)(mg/g)= 胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g);腫瘤指數(shù)(mg/g)= 腫瘤質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g);抑瘤率(%)=(荷瘤模型組腫瘤質(zhì)量-荷瘤藥物實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量)/ 荷瘤模型組腫瘤質(zhì)量×100%。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS14.0，結(jié)果用±s表示，各實(shí)驗(yàn)組之間的比較采用單因素方差(ANOVA)分析，顯著性水準(zhǔn)為=0.05。3 結(jié)果3.1 光鏡觀察正常對(duì)照組小鼠胸腺皮質(zhì)密集分布著核深染的小淋巴細(xì)胞，髓質(zhì)結(jié)構(gòu)較疏松，淋巴細(xì)胞成分較少。在胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)以及皮髓質(zhì)交界處，均分布著一些體積較大、胞體呈多角形或分支狀，核

11、形狀不規(guī)則的淺染細(xì)胞，即為TDCs。荷瘤香菇多糖組TDCs數(shù)量明顯增加，特別在胸腺皮質(zhì)密度很高，位于成簇的淋巴細(xì)胞之間，樹狀突起與淋巴細(xì)胞相接觸。3.2 各組小鼠胸腺指數(shù)、腫瘤指數(shù)和抑瘤率的比較荷瘤小鼠與正常對(duì)照組相比，胸腺指數(shù)均下降，尤其是荷瘤環(huán)磷酰胺組下降更為明顯。應(yīng)用香菇多糖后，胸腺指數(shù)回升接近正常值，與荷瘤環(huán)磷酰胺組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;藥物實(shí)驗(yàn)組腫瘤指數(shù)與荷瘤模型組相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表1。表1 各組小鼠胸腺指數(shù)、腫瘤指數(shù)和抑瘤率的比較與正常鹽水對(duì)照組比較，*P<0.01; 與荷瘤模型組比較，

12、P<0.01;與荷瘤環(huán)磷酰胺組比較，P<0.01;n=101         3.3 香菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠TDCs的影響對(duì)比觀察免疫組化染色及HE染色切片，可見HE染色中顯示的TDCs多數(shù)能表達(dá)S100和CD1a。S100標(biāo)記示TDCs胞漿內(nèi)有深棕色顆粒表達(dá)(部分TDCs細(xì)胞核也有表達(dá))。荷瘤香菇多糖組胸腺皮質(zhì)中見大量S100陽(yáng)性表達(dá)的TDCs，髓質(zhì)有數(shù)量較少的TDCs，但細(xì)胞體積較大，而其他各組胸腺髓質(zhì)S100陽(yáng)性表達(dá)TDCs量很少(見圖1，圖2)。各組小鼠S100+ TDCs所占面積比和TDC

13、s密度的比較見表2。CD1a標(biāo)記主要表達(dá)在TDCs細(xì)胞膜上，呈棕色陽(yáng)性反應(yīng)。因陽(yáng)性較弱，未作圖像分析(見圖3)。表2 各組小鼠TDCs所占面積比和TDCs密度的比較4 討論研究表明，香菇多糖具廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，可通過增加脾細(xì)胞增殖和IL-2的表達(dá)水平，以及通過激活脾細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式增強(qiáng)免疫7。本實(shí)驗(yàn)表明，香菇多糖能改善由于腫瘤以及應(yīng)用環(huán)磷酰胺引致的胸腺指數(shù)下降，與荷瘤環(huán)磷酰胺組比較，有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。注射香菇多糖后能使腫瘤指數(shù)下降，平均瘤重由荷瘤模型組的1.418 1下降為0.916 4，抑瘤率達(dá)到40.817%。對(duì)腫瘤指數(shù)與胸腺指數(shù)兩個(gè)參數(shù)的相關(guān)分析表明兩者為負(fù)相關(guān)關(guān)

14、系(r= -0.660 6,P=0.019 )。這提示：香菇多糖可能通過保護(hù)和恢復(fù)胸腺功能，加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答，達(dá)到抗腫瘤之目的。DCs是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，它幾乎存在于所有哺乳類動(dòng)物組織中，通過識(shí)別和傳遞抗原肽給T細(xì)胞而參與免疫，外周DCs可遷入胸腺，以便更高效率地誘導(dǎo)T細(xì)胞分化增殖，由它激活的細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抗腫瘤中起主導(dǎo)作用8，9。有證據(jù)表明：荷瘤機(jī)體免疫機(jī)制的失能不是由于缺乏腫瘤抗原，而是由于DCs的功能缺陷導(dǎo)致這些抗原不能被有效地提呈給T淋巴細(xì)胞，從而不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生有效而特異性的免疫應(yīng)答。胸腺作為機(jī)體含DCs最多的中樞免疫器官，在抗腫瘤免疫中，TD

15、Cs會(huì)發(fā)生怎樣的變化，鮮有報(bào)道。TDCs有多種在細(xì)胞水平標(biāo)記和識(shí)別的方法。通常用S100標(biāo)記成熟的TDCs，用CD1a標(biāo)記未成熟TDCs。本實(shí)驗(yàn)通過多種樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物聯(lián)合標(biāo)記，結(jié)合光鏡形態(tài)觀察，表明小鼠荷S180肉瘤后，TDCs數(shù)量減少，而在應(yīng)用香菇多糖后TDCs數(shù)量增加。尤其是S100+ TDCs，即成熟TDCs增加，且不僅出現(xiàn)在皮質(zhì)，在胸腺髓質(zhì)也出現(xiàn)較多體積較大的成熟TDCs。與其他各組比較，荷瘤香菇多糖組TDCs密度增加具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。以上結(jié)果表明：香菇多糖能增加TDCs數(shù)量并促進(jìn)其分化成熟，增強(qiáng)其抗原提呈能力，從而加強(qiáng)活化T細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞免疫功能。這可能是香菇多糖抗

16、腫瘤的機(jī)理之一。【】  1 于淑池,林澤平.香菇多糖的營(yíng)養(yǎng)保健及免疫調(diào)節(jié)作用J.承德民族師專學(xué)報(bào), 2003，23(2): 82.2 李廣宙,康 白,張 磊.香菇多糖與IL-2合用對(duì)肺癌浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的影響J.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,22(1):20.3 金亨燮,崔仁花,李承憲.香菇多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥理功效J.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 26 (2):113.4 Mushiake H, Tsunoda T, Nukatsuka M,et al.Dendritic cells might be one of key factors for eliciting antitu

17、mor effect by chemoimmunotherapy in vivoJ.Cancer Immunol Immunother. 2005，54(2):120.5 林卡莉,辛贛海,陳 方.香菇多糖改善S180荷瘤鼠免疫功能的體視學(xué)研究J.組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008，17(4)：398.6 陳同強(qiáng),林卡莉,鄧 婷.香菇多糖對(duì)荷瘤小鼠胸腺、脾和腫瘤的影響J.解剖學(xué)雜志，2008，31(4)：508.7 Chen HL, Li DF, Chang BY, et al.Effects of lentinan on broiler splenocyte proliferation, interleukin-2 production, and signal transductionJ.Poult Sci. 2003，82(5):760.8 Bodey B, Siegel SE, Kaiser HE. Antigen